MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II: Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR 9.Ders ENZİMATİK ANALİZ

Enzimler Enzimler biyolojik katalizörlerdir, yani biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran biyolojik kökenli maddelerdir. 5000’den fazla biyokimyasal reaksiyonu katalizleyebilen enzimlerin hemen hemen hepsi protein yapıdadır.

Enzimlerin en önemli özellikleri: katalitik etkinlik, spesifiklik veregülasyondur.

Katalitik etkinlik Enzimler reaksiyonları yaklaşık 1 milyon kat hızlandırırlar. Normalde biyolojik sistemlerde bu reaksiyonlar gerçekleşir, fakat çok daha yavaş bir şekilde… Bilinen en hızlı enzim karbonik anhidraz dokulardan kana CO 2 taşır ve saniyede 10 5 CO 2 molekülü bağlayabilir. Reaksiyonu 10 7 kat hızlandırır.

Spesifiklik

Regülasyon İnhibitörün bağlanması aktif bölgenin konformasyonel değişimine neden olarak substratın bu bölgeye bağlanmasını engeller. İnhibitör yokluğunda substrat aktif bölgeye (sit) bağlanır ve reaksiyon gerçekleşir İnhibitör Substrat Aktif bölge Allosterik bölge

SINIFLANDIRMA Bilinen tüm enzimler hem reaksiyon özgüllükleri hem de substrat özgüllükleri dikkate alınarak “Enzim Komisyonu (E.C.)” tarafından 6 Temel sınıfa ayrılmıştır. 1. Oksidoredüktazlar 2. Transferazlar 3. Hidrolazlar 4. Liyazlar 5. İzomerazlar 6. Ligazlar

Enzimler şu şekilde numaralandırılmaktadır: WXYZ W  6 büyük sınıf X  Alt sınıflar Y  Alt-alt sınıf Z  Enzimin seri numarası Laktat dehidrogenaz ( ) Oksidoredüktaz CH-OH grubu NAD(P)+ Seri no elektron donörü elektron alıcısı

Üreaz (EC ) Üç boyutlu yapı?

Her enzimin en yüksek aktivite gösterdiği bir optimum pH değeri vardır.

Her enzimin en yüksek aktivite gösterdiği bir optimum sıcaklık derecesi vardır.

GENEL REAKSİYON: Enzim (E), reaksiyonda değişikliğe uğrayacak madde(ler) (Substrat, S) ile reaksiyona girer, reaksiyon tamamlandığında ürün (Ü)(ler) oluşurken enzim tekrar ilk şekline döner. E + S  ES  Ü1 + Ü2 + E

Varlıklarını Etkinliklerini Dokuda/hücrede bulundukları yeri Kataliz mekanizmasını Miktarlarını Saflıklarını belirlemenin en etkin yolu Enzimlerin AKTİVİTE ÖLÇÜMÜDÜR.

ENZİM AKTİVİTESİNİ ÖLÇMEK: Belli bir zaman aralığında enzimin kataliz etkinliği sonucu oluşanDEĞİŞİMİ saptamaktır. ÜRÜN OLUŞUMU SUBSTRAT EKSİLMESİ

DOĞRUSAL Enzimatik bir reaksiyonun başlangıcında değişim DOĞRUSALdır, fakat daha sonra ürün oluşumunda meydana gelen azalma nedeniyle doğrusallık bozulur.

Substratın tükenmesi (Substrat bitince reaksiyon durur. Ölçüm sırasında bitmemesi için yüksek substrat konsantrasyonunda çalışılır.) İki yönlü reaksiyonlarda dengeye yaklaşılması (Reaksiyonun geri dönmesi ile üründen substrat oluşmaya başlar. Bunu önlemek için ürün ortamdan uzaklaştırılır. Ortama, ürünü substrat olarak kullanacak 2. bir enzim veya bağlayacak bir madde eklenir.) NEDENLERİ:

Ürün İnhibisyonu (Ürün enzimi inhibe ediyorsa aktivite kaybolur. Bu nedenle ürün ortamdan uzaklaştırılır.) Enzimin veya reaksiyon bileşenlerinin (substrat, kofaktörler, aktivatörler, reaktifler) stabilitesini kaybetmesi (Her bir bileşenin stabilitesi ön deneylerle saptanmalıdır.) pH değişimi (Reaksiyon sırasında hızlı bir pH değişimi meydana geliyorsa bu da aktiviteyi hızla düşürür. Ortam çok iyi tamponlanmalı, reaksiyonun başında ve sonunda pH kontrolü yapılmalıdır.)

ENZİM AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜLMESİ veHESAPLANMASI UV-VIS ABSORPSİYON SPEKTROFOTOMETRİSİ FLUORESANS SPEKTROFOTOMETRİSİ RADYOAKTİF YÖNTEMLER katalitik aktivitesini Enzimlerin doku ve hücrelerdeki konsantrasyonu son derece düşük olduğundan miktarlarını ölçmek çok güçtür. En iyi ölçme yöntemi enzimin katalitik aktivitesini ölçmektir.

ENZİM AKTİVİTESİNİ ÖLÇMEK: DEĞİŞİM Belli bir zaman aralığında enzimin kataliz etkinliği sonucu oluşan DEĞİŞİM saptanır. ÜRÜN OLUŞUMU SUBSTRAT EKSİLMESİ SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLERLE Enzim miktarı, genelde, enzim konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak meydana gelen ürün miktarı ölçülerek saptanır.

Başlangıç Hızı "Initial rate": v o Aktivite ölçümü, henüz reaksiyon hızında bir düşmenin olmadığı kısa zaman aralığında yapılır.

Güvenilir Güvenilir bir ölçüm için: Enzim ve substrat derişimi reaksiyonun optimum hızda gerçekleşmesine yetecek şekilde ayarlanmalı, Sıcaklık kontrol altında tutulmalı, Ölçüm yapılan karışımın homojen olması sağlanmalı, Çok sağlıklı kör ve kontrol ölçümleri yapılmalıdır.

KÖR (BLANK) Çalışılan dalga boyundaki ışını absorplayacak maddeyi içermeyen reaksiyon ortamı KONTROL(LER) Reaksiyon ortamındaki etkinliği şüpheli olan bileşenler (ör. Koenzimler)

SPEKTROFOTOMETRİK ÖLÇÜM Spektrofotometre ölçümden dak önce çalıştırılır; çalışma ortamının sıcaklığı ayarlanır; doğru ve temiz küvetler seçilir. Reaksiyonu başlatacak bileşen hariç diğer tüm bileşenler küvete (çift ışınlı aletlerde her iki küvete) konulur. Alet sıfırlanır ("Auto-Zero"). Reaksiyonu başlatacak bileşen eklenir ve etkin bir şekilde karışması sağlanarak ölçüm yapılır.

Yüksek K m değeri söz konusu ise aktivite ölçümünde substrat konsantrasyonu yüksek tutulmalıdır. safOlanaklar el verdiği ölçüde saf enzimle çalışmakta yarar vardır. Çözelti şeklinde saklanan enzimlerde zamanla aktivite kaybı olacağı unutulmamalıdır. Liyofilize halde saklamak daha elverişlidir. Ölçümlerde kullanılan kimyasalların saf olması şarttır. Kalite ne kadar yüksek olursa, hata payı o kadar azalır. Cam eşyaların temiz olması, deterjan artığı bulunmaması, saf suyun yüksek kalitede olmasına özen gösterilmelidir. Reaksiyon karışımına katılacak maddelerin pH'ları elverişli olmalıdır. TEKNİK OLARAK DİKKAT EDİLMESİ GEREKEN NOKTALAR !!!

ENZİM AKTİVİTESİNİN HESAPLANMASI: Birimler ve Spesifik Aktivite Absorpsiyon (Ekstinksiyon) Katsayısı Spektrofotometrik ölçümün dayandığı Beer-Lambert yasasına göre Absorbans (A; ya da Optik Dansite, O.D.), absorpsiyon yapan maddenin derişimi (c) ve ışının katettiği yol (d) ile doğru orantılıdır: A=  cd Buna göre: c = A  d c = A  (1 cm)

Derişimi 1 M olan bir kromoforun, ışık yolu 1 cm olan bir spektrofotometrede ortaya koyduğu absorbans Molar Absorpsiyon (Ekstinksiyon) Katsayısı (  ) olarak tanımlanır. Birimi M -1 cm -1 'dir. (lmol -1 cm -1 veya mmol -1 cm 2 'ye eşdeğerdir) cm 2 mol -1 (M -1 cm -1 'in 1000 katı) olarak da ifade edilir A=  cd 1 cm 1 M

Bu durumda hesaplanan derişimin (c'nin) birimi M (mol/l)'dır.

Bir enzimin aktivitesini çeşitli biçimlerde ifade edilebilir: Örneğin, Birim zamanda enzim tarafından meydana getirilen absorbans değişimi: (dA/dt) Ancak daha standart bir birim olan ÜNİTE (U; "International Unit", IU) ÜNİTE (U; "International Unit", IU) daha geniş kullanım alanı bulur. Enzim Aktivitesinin Tanımlanması

Buna göre 1 Ünite Enzim, 1 dakikada 1  mol ürünün oluşumunu (veya 1  mol substratın dönüşümünü) katalizleyen enzim miktarıdır (U=  mol /dak) (Optimum koşullarda!!!) Ölçü birimi olarak Internasyonel Unite (IU) veya Ünite (U) kullanılır. ÜNİTE ENZİM

Örnekteki Enzim Ünitesi = V t x dA/dt x 1000 x sulandırma faktörü  v s x d Deneysel Ölçümlerin Üniteye Dönüştürülmesi V t = Reaksiyon karışımının toplam hacmi (ml) dA/dt = dakikada Absorbans değişimi (dak -1 )  = Absorpsiyon katsayısı (cm 2 mol -1 ) V s = Reaksiyon ortamına katılan örnek (enzim) hacmi (ml) d = küvetteki ışık yolu (genellikle 1 cm) 1000 çarpanı enzimi  mole çevirmek içindir.

Saf bir enzimin spesifik aktivitesi sabittir ve o enzime özgü bir değerdir. Bu aktivite birimi, enzimin saflığını tanımlayan bir ölçüttür. Ham özütlerde protein derişimi yüksektir. Dolayısıyla ilgilenilen enzimin spesifik aktivitesi DÜŞÜK çıkar. Enzimi SAFLAŞTIRDIKÇA spesifik aktivitesi YÜKSELİR. SPESİFİK AKTİVİTE = U/mg protein