1. Susceptibilitatea bacteriei Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. la uleiul volatil din pericarpul de Citrus maxima Osbeck Crina Saviuc, Luminia Măruescu, Marcela Bucur, Bogdan Savu, Mariana Carmen Chifiriuc, Eliza Oprea, Tatiana Eugenia esan, Veronica Lazăr Universitatea din Bucureti Facultatea de Biologie

2. Introducere „Nu există o boală a pomilor fructiferi mai distructivă ca „focul bacterian” al rozaceelor” (M.B. Waite, 1895). “Focul bacterian” al rozaceelor este cea mai păgubitoare boală a speciilor pomicole seminţioase, a căror producţie se bazează pe întreaga durată de viaţă (15-20 ani), patogenul putând distruge un pom în numai 6 luni de la infecţie (Vlad, 2003).

3. Simptomele de „foc bacterian” sunt uşor de diferenţiat. Există cinci stadii ale bolii: arsura inflorescenţelor, arsura lăstarilor, ulcere, arsura altoiului, arsuri asociate leziunilor produse în mod natural (Naqvi, 2004). Probe de Malus sp. (A) i Pyrus sp. (B) cu simptome de „foc bacterian”: arsura şi c ȃ rja caracteristică a lăstarilor. A – joncţine ţesut vegetal sănătos – ţesut necrozat. ( Luminita Marutescu. “Caracterizarea fenotipică şi genotipică aplicată în taxonomia unor tulpini de Erwinia amylovora, agentul etiologic al focului bacterian al rozaceelor” (teza de doctorat). 2010.) Introducere

4. Ȋ n România „Focul bacterian” al rozaceelor a fost semnalat pentru prima dată, în anul 1992, în două localităi diferite: Brăila i Mărăcineni- Arge (Severin 1996). Boala a avut o evoluţie rapidă, astfel că în 1993 a fost semnalată în alte 19 localităţi din 9 judeţe (Constantinescu şi colab., 1994) În anul 1994 a fost depistată în alte 5 judeţe (Severin i colab., 1999). În 1995 în18 judeţe (Severin şi colab., 1999). În 1996 a fost raportată în 23 de judeţe (Severin şi colab., 1999). În anul 1998 a fost depistată în 37 de judeţe. În anul 2000 în toate judeţele ţării (Vlad, 2003).

5. Erwinia amylovora organism de carantină fitosanitară Agentul etiologic al bolii „focul bacterian al rozaceelor”, E. amylovora este un organism de carantină reglementat (Directiva Uniunii Europene nr. 2000/29 EC; în România prin: Ordinul MADR nr. 28/1993, Ordonanţa de Guvern nr. 136/2000, HG. nr. 1135/2004, HG. nr. 563/2007, Ordinul MADR nr. 583/2007 şi Ordinul MADR nr. 61/2008). E. amylovora produce boala „focul bacterian” la arbori şi arbuşti din familia Rosaceae, având un spectru larg de plante-gazdă în interiorul familiei. Familia Rosaceae prezintă o importanţă economică deosebită. Cele mai importante specii, atât din punct de vedere economic cât şi epidemiologic, sunt: Amelanchier alnifolia, A. canadensis, Chaenomeles sp., Cotoneaster sp., Crataegus sp., Cydonia oblonga, Malus sp., Eriobotrya japonica, Mespilus germanica, Pyracantha sp., Pyrus sp., Pyrus amygdaliformis, Sorbus sp., Stranvasia davidiana. Introducere

6. Un control eficient al bolilor la plante presupune integrarea unor metode variate de protecţie (agrofitotehnice, chimice şi biologice), eliminarea sursei de infecţie (tăieri, arderi) precum şi creşterea rezistenţei plantelor la infecţie (Mikiciński şi colab., 2008). În ultimele două decenii, metodele biologice de control au evoluat de la studii fundamentale la o componentă a strategiilor de control integrate (Jonhson şi Stockwell, 2000). Introducere Metode agrofitotehnice: măsuri de carantină utilizare de material de plantare certificat măsuri sanitare măsuri de fertilizare şi cultivare tăieri sisteme de prognoză a “focului bacterian” al rozaceelor Metode chimice: compuşi pe bază de cupru antibiotice Metode biologice: tulpini microbiene cu activitate antibacteriană faţă de E. amylovora extracte vegetale.a.

7. Scop i obiective Scop: Studiul sensibilităii bacteriei Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. la uleiul volatil din pericarpul de Citrus maxima Osbeck. Obiective: Extracia i caracterizarea uleiului esenial din pericarp de Citrus maxima Determinarea calitativă a sensibilităii bacteriei Erwinia amylovora la uleiul volatil din pericarp de Citrus maxima Evaluarea cantitativă a capacităţii de inhibiţie a uleiului volatil asupra aderenţei tulpinilor bacteriene la suprafaţa diferitelor fragmente de frunze de Pomoideae Evidenţierea cu ajutorul microscopiei confocale a capacităţii de inhibiţie a aderenţei microbiene de către uleiul de C. maxima

8. Materiale i metode 1. Extracia i caracterizarea uleiului esenial din pericarp de Citrus maxima 1.A Extracia uleiului volatil -Material vegetal- pericarp de C. maxima uscat sau proaspăt -Instalaie de obinere a uleiurilor volatile Neo- Clevenger Metoda: Extracie continuă Principiul metodei: antrenarea cu vapori 1.B Caracterizarea uleiului volatil -Soluia stoc de ulei volatil -Cromatograf de gaze Fisons InstrumentsGC8000, cuplat cu spectrometru de masă cu ionizare prin impact i analizor quadrupol Metoda: cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă Principiul metodei: eluarea gradată a compuilor din coloană identificarea comparativă a compuilor

9. 2. Determinarea calitativă a sensibilităii bacteriei Erwinia amylovora la uleiul volatil din pericarp de Citrus maxima Materiale: -Mediu LB turnat în plăci Petri (grosime 3-4mm, pH 7.2) -Inocul suspensie bacteriană 0.5 McFarland (1.5x10 8 ) -Soluie stoc ulei volatil Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer Principiul metodei: corelarea creterii bacteriene cu difuzia substanei de cercetat în mediul de cultură Două tulpini de E. amylovora au fost utilizate pentru evaluarea activităţii antimicrobiene a uleiului esenial de C. maxima. Ea35 Ramuri cu frunze - Malus sp. 2005 Mehedinţi Ea36 Ramuri cu frunze - Malus sp. 2005 Mureş

10. 3. Evaluarea cantitativă a capacităţii de inhibiţie a uleiului de pomelo asupra aderenţei tulpinilor bacteriene la suprafaţa diferitelor fragmente de frunze de Pomoideae - fragmente de frunze; - inocul suspensie bacteriană 0.5 McFarland (1.5x10 8 UFC/mL) - soluie stoc ulei volatil Metoda diluiilor adaptată: - pretratament cu ulei volatil al fragmentelor de frunze în cinci variante de lucru (1,2,3,5,10min.); - colonizarea bacteriană; - studiu comparativ UFC/mL între martorii pozitivi i probele pretratate. Materialul vegetal utilizat pentru studiul influenţei uleiului de pomelo asupra capacităţii de aderenţă a tulpinilor de E. amylovora

11. 4. Evidenţierea cu ajutorul microscopiei confocale a capacităţii de inhibiţie a aderenţei microbiene de către uleiul de pomelo -microscop CSLM TGS-SP Leica dotat cu PL FLUOTAR si un laser Ar-Fe reglat la 488nm -fragmente de frunze colonizate cu E. amylovora: frunze pretratate cu ulei volatil, martor pozitiv -martor negativ frunze imersate în AFS  S-a obţinut o rezoluţie laterală de 200 nm.  Software-ul Leica s-a utilizat pentru examinarea topografiei suprafeţei şi pentru analiză statistică.  CSLM se bazează pe principiul eliminarii luminii directe din planurile din afara focalizării prin intermediul unor aperturi confocale.  Analiza topografiei este posibilă prin înregistrarea unor serii de imagini pe axa z.

12. Rezultate i discuii Soluţia stoc de ulei volatil s-a obţinut după practicarea a 6 extracţii. Concentraţia medie de ulei (mL ulei/100g material vegetal uscat) fiind de 0.87% pentru materialul vegetal uscat, iar pentru materialul vegetal proaspăt (mL ulei/ 100g material vegetal proaspăt), de 0.37%.

13. Rezultate i discuii Ilustrarea activităţii antimicrobiene a uleiului de pomelo faţă de tulpina E. amylovora Ea36. Investigarea proprietăţilor antimicrobiene ale uleiului de pomelo a arătat că acesta manifestă un efect inhibitor asupra: creşterii microbiene; capacităţii de aderenţă a celulelor de E. amylovora la suprafaţa frunzei.

14. Rezultate i discuii Analizele cantitative ale efectului inhibitor manifestat de uleiul de pomelo asupra aderenţei au arătat că acest efect inhibitor este dependent de: timp; planta gazdă. Investigarea proprietăţilor antimicrobiene ale uleiului de pomelo a arătat că acesta manifestă un efect inhibitor asupra: creşterii microbiene; capacităţii de aderenţă a celulelor de E. amylovora la suprafaţa frunzei.

15. Reprezentarea grafică a influenei uleiului de pomelo asupra aderenei tulpinilor de E. amylovora la suprafaa frunzei Rezultate i discuii

16. Microscopia confocală a confirmat rezultatele determinărilor cantitative ale influenţei uleiului de pomelo asupra aderenţei microbiene, neevidenţiind la suprafaţa frunzei supusă tratamentului timp de 5 minute cu ulei de pomelo, celule bacteriene de E. amylovora aderate.

17. C Evidenierea cu ajutorul CSLM a efectului de inhibiie exercitat de uleiul de pomelo asupra aderenei bacteriene: A.Martor negativ (fragment de frunză de Cydonia sp. imersat ȋ n apă distilată sterilă) B.Martor pozitiv (fragment de frunză de Cydonia sp. imersat ȋ n suspensie bacteriană de E. amylovora Ea7) C.Fragment de frunză de Cydonia sp. tratat timp 5 minute şi apoi imersat pentru 2 ore ȋ n suspensie de E. amylovora. Microscopia confocală a evidenţiat în cazul fragmentelor de frunze martor pozitiv (netratate cu ulei) celule bacteriene aderate la suprafaţa frunzei în timp ce pe suprafaţa frunzelor tratate cu ulei de pomelo nu au fost evidenţiate celule bacteriene de E. amylovora. Rezultate i discuii

18. Concluzii Investigarea proprietăţilor antimicrobiene ale uleiului de pomelo a arătat că acesta manifestă un efect inhibitor atât asupra creşterii microbiene cât şi asupra capacităţii de aderenţă a celulelor de E. amylovora la suprafaţa frunzei. Rezultatele preliminare referitoare la activitatea antimicrobiană a uleiului de pomelo recomandă acest extract vegetal pentru continuarea cercetărilor în vederea obinerii unui nou mijloc de biocontrol, pentru strategiile alternative de combatere a focului bacterian al rozaceelor la pomii fructiferi.

19. Bibliografie selectivă: Johnson K.B. and Stockwell V.O. Biological Control of Fire Blight. In Vanneste J.L. (Ed). Fire blight: the Disease and its Causative Agent, Erwinia amylovora. 2000. CABI Publishing Wallingford. Pages 319-337. Marutescu L. “Caracterizarea fenotipică şi genotipică aplicatăîn taxonomia unor tulpini de Erwinia amylovora, agentul etiologic al focului bacterian al rozaceelor” (teza de doctorat). 2010 Mikiciński P., Sobiczewski S. and Berczyński S. Selection of bacteria from epiphytic populationson apple trees and soil environment for ability to control fire blight (Erwinia amylovora) Phytopathol. Pol. 2008. 47: 43–55. Naqui S.A.M.H. Diseases of fruits and vegetables: diagnosis and management. Springer, 2004. 66-82. Stanciu Gh., Savu B.,Hristu R. CLSM – Application in the investigation of microbial biofilms. Workshop Medical significance of microbial biofilms. 2008. Vanneste J.L. Inhibition of Erwinia amylovora and Potential Antagonistic Bacteria by Essential Oils and Natural Compounds. Proc. 9th Int. Workshop on Fire Blight. Eds. C. Hale and R. Mitchell. Acta Hortic. 2002.590. Vlad F. Epidemiologia si prevenirea focului bacterian al rozaceelor (Erwinia amylovora). (teza de doctorat). 2003. Vă mulumesc!