1. Explorarea hemostazei secundare
Lucrare practică

2. Cuprins
Hemostaza secundară – date generale Teste de screening: - Timpul de coagulare activat - Timpul de tromboplastină parțială activat – APTT - Timpul de protrombină – Timp Quick - Timpul de trombină -Timpul de reptilază Teste speciale: - Teste bazate pe proprietăți vasoelastice ale sângelui – tromboelastografia, tromboelastometria rotativă - Testul antifactor Xa - Mixing studies - Concentrația factorilor coagulării Exemple practice

3. Cascada coagulării TF(III)-VIIa IX XI X XIIa PL XIa Protrombina (II)
XIIIa
XIII
Trombina (IIa)
Polimeri
Fibrină
Fibrinogen (I)
Monomeri
Fibrina (Ia)
Protrombina (II) Xa Va
PL, Ca2+ X
Calea extrinsecă XI
XIa
Calea intrinsecă
HMW Kininogen IX
IXa
VIIIa
Ca2+
XIIa
Colagen
Prekalicreina
XII
Calea comună
[A good review of the history of the blood coagulation model as well as the recent advances can be found in Clinical Hemostasis Review Volume 16, Number 6 – June 2002, written by Dr. Dorothy Adcock.]

5. Modelul clasic al coagulării
- cascada coagulării pe căile intrinsecă și extrinsecă
cele două căi devin comune după
formarea complexului FXa/FVa
rezultă formarea trombinei care clivează fibrinogenul în fibrină
are loc stabilizarea cheagului plachetar
- acest model este util înțelegerii testelor de laborator dar nu reflectă procesul coagulării in vivo

6. Modelul actual (celular) al coagulării
este bazat pe o singură cale comună
interacțiunea dintre factorul tisular și FVII se
desfășoară în 3 faze:
Inițierea cheagului – presupune generarea unei
cantități infime de trombină, suficientă însă pentru
a iniția formarea cheagului și a activa plachetele
Amplificarea cheagului – generarea trombinei este
crescută prin feed-back pozitiv prin activarea
cofactorilor, FXI și a plachetelor
Propagarea cheagului – generarea cantităților
hemostatice de trombină

7. Explorarea hemostazei secundare 1
Explorarea hemostazei secundare 1. Timpul de coagulare activat (activated clotting time - ACT)
reprezintă timpul necesar coagulării sângelui proaspăt recoltat după adăugarea unor activatori de contact (caolin, bile de sticlă) care activează calea intrinsecă a coagulării
este folosit preponderent pentru monitorizarea terapiei cu doze foarte mari de heparină, utilizate în chirurgia cardio-pulmonară
Valori normale: sec
Valori în chirurgia țintă: > 480 sec

8. Explorarea hemostazei secundare 1
Explorarea hemostazei secundare 1. Timpul de coagulare activat (activated clotting time - ACT)
Utiltatea ACT este limitată în general la monitorizarea terapiei cu heparină în doze mari în chirurgia cardiopulmonară deoarece este influențat de numeroase variabile:
numărul și funcția trombocitelor
prezența inhibitorilor coagulării
deficit de factori ai coagulării, etc

9. Explorarea hemostazei secundare 2
Explorarea hemostazei secundare 2. Timpul de tromboplastină parțială activat (APTT)
Reprezintă un test funcțional ce explorează calea intrinsecă, inclusiv calea comună (VIII, IX, XI, XII, fibrinogen, II, V, X), independent de funcția plachetară
Măsoară timpul necesar coagulării:
Plasmă săracă în trombocite + fosfolipide + activator al căii intrinseci (siliciu, caolin) + calciu
VN: sec
După recoltare prin venopunctură, proba de sânge se trimite la laborator în maxim 1h  în cazul întârzierii, poate rezulta o falsă alungire a APTT datorită degradării F VIII

10. Explorarea hemostazei secundare 2
Explorarea hemostazei secundare 2. Timpul de tromboplastină parțială activat (APTT)
In vivo – sistemul de contact este implicat atunci când sângele interacționează cu o suprafață străină
Zimogenul FXII se leagă de suprafețe încărcate negativ (caolin, dextran sulfat, sulfatide)  are loc autoactivarea F XII  F XIIa acționează asupra prekalicreinei si a FXI  kalikreina si F XIa
Kalicreina clivează kininogenul cu greutate moleculară mare eliberând bradikinina și kininogen activat
In vitro – activarea este realizată prin adăugarea unei “tromboplastine parțiale”, compusă doar din fosfolipide (nu conține factorul tisular, ca în “tromboplastina completă”) și a unui activator de suprafață (silica)
- Calciul adăugat are rolul de a satura citratul prezent în probă, pentru a se putea desfășura coagularea

11. Explorarea hemostazei secundare 2
Explorarea hemostazei secundare 2. Timpul de tromboplastină parțială activat (APTT)
Prelungirea APTT – exemple:
Toate deficitele congenitale ale factorilor căii intrinseci – ex hemofiliile A, B
Terapia cu inhibitori ai coagulării – heparina
Prezența anticoagulanților circulanți – ex factor specifici (anti factor VIII sau antifactor IX la unii pacienți cu hemofilie); factor nespecifici (anticoagulantul lupic)
Consumul factorilor coagulării – CID
Scăderea sintezei hepatice a factorilor proteici ai coagulării în afecțiunile hepatice severe

12. Explorarea hemostazei secundare 2
Explorarea hemostazei secundare 2. Timpul de tromboplastină parțială activat (APTT)

13. Explorarea hemostzei secundare 2
Explorarea hemostzei secundare 2. Timpul de tromboplastină parțială activat (APTT)
Monitorizarea terapiei cu heparină
Heparina – amestec heterogen de fragmente polizaharidice cu greutăți moleculare diferite dar cu activitate biologică similară
fragmentele mai mari își exercită efectul anticoagulant interacționând cu antitrombina III pentru a inhiba trombina
ATIII, principalul anticoagulant al organismului, inactivează trombina și inhibă activitatea FXa
Fragmentele de heparină cu greutate moleculară mică inhibă activitatea FXa
Complicațiile hemoragice se asociază în general cu tratamentul cu molecule de heparină mari, cu greutate moleculară ridicată

14. Explorarea hemostzei secundare 2
Explorarea hemostzei secundare 2. Timpul de tromboplastină parțială activat (APTT)
Monitorizarea terapiei cu heparină
APTT nu se folosește pentru monitoriazrea tratamentului cu heparină cu greutate moleculară mică, ce acționează în principal pe F Xa
Dozele mici de heparină subcutanată (profilactice, 5000 U x 2-3/zi) nu modifică APTT și necesită doar monitorizarea Tb pentru a exclude trombocitopenia indusă de heparină
Dozele mari de heparină nefracționată se monitorizează repetând APTT din 6 în 6 h în prima zi, apoi o dată pe zi dacă se atinge intervalul terapeutic al APTT și la 6 ore după orice modificare a schemei terapeutice

15. Explorarea hemostazei secundare 3
Explorarea hemostazei secundare 3. Timpul de protrombină-TP (Timpul Quick-TQ)
Evaluează activitatea factorilor implicați pe calea extrinsecă, inclusiv calea comună a coagulării: F VII , F X, F V, F II, F I
Factorii coagulării II, VII, IX și X sunt sintetizați în ficat sub formă inactivă
Acești factori proteici au în comun reziduurile de acid gama glutamic carboxilic (Gla) la capătul N terminal al moleculei, care necesită prezența vitaminei K pentru sinteză și care sunt esențiale pentru legarea calciului
TP este util pentru monitorizarea tratamentului anticoagulant cu anatgoniști ai vitaminei K – acenocumarol (Sintrom), warfarină (Coumadin)
Valori normale TP/TQ = sec

16. Explorarea hemostazei secundare 3
Explorarea hemostazei secundare 3. Timpul de protrombină-TP (Timpul Quick-TQ)
TQ reprezintă timpul necesar coagulării unei mostre de sânge recoltată pe citrat de sodiu, peste care se adaugă calciu și tromboplastină tisulară (factor 3 tisular) In vivo – coagularea pe calea sistemul extrinsic este inițiată când factorul tisular este legat de factorul VIIa  complexul enzimatic VIIa-factor tisular activează FIX și FX  FXa interacționează cu FVa  complexul protrombinazic rezultat este suficient pentru a genera o cantitate mică de trombină în vecinătatea celulelor care exprimă factor tisular In vitro – tromboplastina tisulară ce se adaugă la plasma anticoagulată cu citrat, săracă în trombocite este o mixtură de vezicule fosfolipidice și factor tisular - factorul tisular fiind absent din plasma normală, trebuie furnizat dintr-o sursă externă și astfel cascada reacțiilor declanșate în TP este cunscută sub denumirea de “cale extrinsecă”

17. Explorarea hemostazei secundare 3
Explorarea hemostazei secundare 3. Timpul de protrombină-TP (Timpul Quick-TQ)
Situații în care se poate detecta PT prelungit – exemple:
Tratament cu anticoagulante orale
Deficit ereditar de factori ai coagulării (II, V, VII, X)
Deficit dobândit al sintezei factorilor coagulării – ex în insuficiența hepatocelulară PT este afectat mai devreme și mai sever decât APTT (factorul VII are cel mai mic timp de înjumătațire, factorii XI și XII au cel mai lung timp de înjumătățire)
Consumul factorilor coagulării – CID
Deficit de vitamina K

18. Explorarea hemostazei secundare 3
Explorarea hemostazei secundare 3. Timpul de protrombină-TP (Timpul Quick-TQ)

19. Explorarea hemostazei secundare 3
Explorarea hemostazei secundare 3. Timpul de protrombină-TP (Timpul Quick-TQ)
Monitorizarea terapiei cu anticoagulante orale
Deoarece PT este influențat de tipul de reactiv și de aparatura folosite (în funcție de producător) – pt monitorizarea terapiei cu anticoagulante orale folosim INR (International Normalised Ratio )
International Normalised Ratio (INR) este raportul intre PT al unei probe test comparata cu un PT normal (derivat din media log PT normale (LMNPT) a 20 donori sanatosi) corectat ISI.
ISI - indice de sensibilitate al tromboplastinei folosit în laborator
Valori normale INR: 0,8-1,2
INR = ( TQpacient/TQmartor ) x ISI
Slide 34

20. Explorarea hemostazei secundare 3
Explorarea hemostazei secundare 3. Timpul de protrombină-TP (Timpul Quick-TQ)
Exemple de valori ţintă pentru ca un tratament anticoagulant oral să fie eficace:
Profilaxia trombozei la pacienţi cu fibrilaţie atrială cronică: INR 2-3
Profilaxie trombembolism pulmonar: INR 3-4
Valori ale INR > 5 – risc de mortalitate ridicată
Supradozare anticoagulante orale – administrare de vit K sau de plasmă proaspătă

21. Explorarea hemostazei secundare 3
Explorarea hemostazei secundare 3. Timpul de protrombină-TP (Timpul Quick-TQ)
Monitorizarea terapiei cu anticoagulante orale
După inițierea terapiei cu anticoagulante orale sau modificarea dozei este necesară o perioadă de câteva zile până la instalarea efectului anticoagulant la nivelul dorit – se va determina INR zilnic.
După stabilirea dozei de anticoagulant intervalul între determinări va fi alungit gradual până la determinarea INR o dată pe lună.

22. Explorarea hemostazei secundare 4. Timpul de trombină (TT)
- TT este foarte sensibil la prezența heparinei, putând detecta doze mici de heparină
- nu este standardizat pentru monitorizarea terapiei cu heparină
- TT prelungit  mixare cu un volum egal de plasmă normală
TT amestec alungit - prezență heparină
TT amestec normal – hipofibrinogenemie sau disfibrinogenemie

23. Explorarea hemostazei secundare 4. Timpul de trombină (TT)
- peste plasma săracă în trombocite se adaugă trombină (factorul IIa) şi CaCl2 => “scurtcircuitarea” tuturor căilor coagulării, până la activarea fibrinogenului
- trombina clivează fibrinogenul eliberând fibrinopeptide și convertindu-l la fibrină
- diagnosticare disfibrinogenemiilor (fibrinogen disfuncțional) sau hipofibrinogenemiilor
Valori normale: sec.

24. Explorarea hemostazei secundare 4. Timpul de trombină (TT)
Alungirea TT poate fi întâlnită în :
Disfibrinogenemia sau hipofibrinogenemia ereditară
Disfibrinogenemia dobândită – ex afecțiuni hepatice
Consumul fibrinogenului – CID

25. Explorarea hemostazei secundare 4. Timpul de trombină (TT)

26. Explorarea hemostazei secundare 5. Timpul de reptilază (TR)
- se efectuează ca şi TT dar în locul trombinei se folosește reptilaza
- spre deosebire de trombină, reptilaza nu este afectată de inhibitorii trombinei, deci TR nu este influenţat de folosirea anticoagulantelor
- valori normale: sec

27. Explorarea hemostazei secundare 6
Explorarea hemostazei secundare 6. Tromboelastografia, tromboelastometria rotativă
afișează grafic modificările vâscoelastice ale cheagului, pe măsură ce se dezvoltă și se dizolvă
parametrii măsurați includ timpul de închegare, cinetica cheagului, fermitatea cheagului, amplitudinea, forța maximă și liza cheagului
aceste teste se efectuează din sânge total și se pot realiza la patul bolnavului
Investighează coagularea în ansamblu, inclusiv funcția plachetară și fibrinoliza

28. Explorarea hemostazei secundare 7. Testul antifactor Xa
este utilizat în special pentru monitorizarea terapiei cu heparină cu greutate moleculară mică (LMWH – low molecular weight heparine)
LMWH nu modifică APTT semnificativ
dacă probele nu sunt livrate imediat, Tb eliberează factori plachetari ce neutralizează heparina nefracționată sau heparina cu greutate mică.
- monitorizarea terapiei cu heparină cu greutate mică este necesară în caz de insuficiență renală (scade clearenceul medicamentului), sarcină (crește necesarul în trim III), etc
nu este standardizat pentru monitorizarea terapiei de profilaxie a trombozei venoase profunde
Valori test:
- Terapie cu heparină tromboză venoasă:
0,3-0,7 U/ml

29. Explorarea hemostazei secundare 7. Testul antifactor Xa
Plasmă săracă în Tb + factor Xa în cantitate cunoscută + antitrombină în cantitate cunoscută
Testul pentru heparină anti-FXa se bazează pe abilitatea heparinei de a inhiba activitatea FXa din reactiv, care conține de asemenea un exces de antitrombină, astfel încât heparina din probă să fie agentul care limitează rata inhibiției FXa
Heparina din probă inhibă transformarea enzimatică a substratului cromogen de către FXa
Astfel, nivelul activității reziduale al FXa este invers proporțional cu concentrația de heparină din plasma pacientului

30. Explorarea hemostazei secundare 8. Mixing studies
- Util pentru stabilirea etiologiei valorilor crescute ale APTT sau PT
- plasmă săracă în Tb obținută cât mai rapid de la momentul recoltării - maxim 4 ore
- APTT alungit - inițial se efectuează un test de neutralizare a heparinei
- plasma pacientului se mixează cu un volum egal de plasmă normală și se reefectuează APTT pentru amestec

31. Explorarea hemostazei secundare 8. Mixing studies
- APTT amestec normal – deficit de factor de coagulare ce a fost suplinit prin plasma normală –> sunt indicate teste de identificare a factorului/factorilor afectați
- APTT amestec alungit – prezența unui inhibitor al coagulării –> cel mai frecvent lupus anticoagulant sau substanță medicamentoasă
Slide 34

32. Explorarea hemostazei secundare 9
Explorarea hemostazei secundare 9. Teste de identificare a concentrației factorilor de coagulare
- deficitul ereditar izolat al unui factor al coagulării este rar, cel mai frecvent pacienții prezintă deficite multiple dobândite – afecțiuni hepatice, CID, prezența de inhibitori ai coagulării, etc
- se evită contaminarea cu heparină – rezultate fals negative prin inhibarea factorilor II, IX, X, XI și XII
nivelul unui factor se exprimă în procente – valoarea normală 100% (1 U/ml) pentru fiecare factor
- se efectuează după ce s-au efectuat mixing studies
- pentru ca APTT sau PT să se alungească este necesar un deficit izolat al unui factor al coagulării > 55% sau deficite multiple

33. Exemple practice - 1
O pacientă în vârstă de 2 ani, normal dezvoltată, este adusă pentru un consult de părinții ei, care au observat că se “învinețește ușor”. Testele de coagulare arată: PT = 13s N: 11-14s APTT = 105s 23-35s TT = 13s 10-13s Fibrinogen = 270mg/dl mg/dl Cum ați investiga în continuare pacienta?

34. Exemple practice - 1
repetarea analizelor pentru excluderea unei erori de laborator
La testul de mixare cu plasma normală, APTT se normalizează  exclude prezența unui inhibitor și sugerează absența unui factor al coagulării
Ce test de identificare a factorului care este absent ați solicita?
APTT este alungit și PT este normal.
Deficitul de FXII poate prelungi APTT dar nu se asociază cu tendință de sângerare (are rol important pentru declanșarea coagulării in vitro, absența sa in vivo este asimptomatică).

35. Exemple practice - 1
Ar putea fi absent unul din factorii: FVIII, FIX, FXI, FvW. Solicitarea FvW se poate amâna până la primirea rezultatului dozării FVIII. Rezultate: FVIII scăzut < 1 UI/dl FIX normal FXI normal FvW normal Care este diagnosticul?

36. Exemple practice - 1 Hemofilia A
- deficitul FVIII plasmatic funcțional
boală X linkată recesivă, moștenită sau datorată unor mutații spontane
în funcție de nivelul activității FVIII, se poate manifesta prin echimoze apărute ușor, coagulare neadecvată în urma injuriilor, chiar hemoragie sponatnă în cazurile grave
Diferențierea hemofiliei A de boala von Willebrand se face utilizând teste de explorare a FvW
Ce valori vă așteptați să decelați în hemofilia A pentru: Timpul de sângerare?
Metoda aglutinării plachetare cu ristocetină?

37. Exemple practice - 2 Interpretati rezultatele testelor: Nr trombocitePT
APTT TT
Fibrinogen
Normal ↑ ↓
Normla

38. Exemple practice - 2 Interpretați rezultatele testelor: Nr trombocitePT
APTT TT
Fibrinogen
Interpretare - exemple
Normal ↑
Deficit al căii comune – ex deficit FV, FX
Deficit multiplu al factorilor de coagulare – ex deficit combinat de FII, V, X, VII, IX
Tratament cu antagoniști ai vit K
Deficit de vit K ↓
↑/↓
CID
Boală hepatică severă
Boală primară a plachetelor – ex distrucția imunologică a trombocitelor

39. BIBLIOGRAFIE
Hoffman M, Monroe DM. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis. Hematol Oncol Clin North Am 2007;21:1-11.
O'ShaughneSNVS D, Makris M, Lillicrap D. Practical hemostasis and thrombosis. Blackwell Publishing 2006.
Porth CM. Essentials of pathophysiology (ed 5). Lippincott Williams & Wilkins 2011
Daniela Filipescu. Hemostaza normală și patologică. SRATI 2010
estions/data_interpretation_screening_tests.html