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基因重组和基因工程 Genetic recombination and genetic engineering 4.1 中心法则（ “ 信息流 ” 法则） （提示理解） 4.2 DNA 重组 DNA Recombination

DNA 重组的概念： p50 解析 DNA 重组的三个突破性发现（指导学习） 1. 限制性核酸内切酶 2. DNA 连接酶 3. 逆转录酶 DNA 重组的过程（步骤，后述） DNA 重组的应用简介 p52

DNA 重组的种类简介（补充） 2. 接合作用 (conjugation) 3. 转化作用 (transformation) 4. 转导作用 (transduction) 6. 转 座 (transposition) 1. 同源重组 (homologous recombination) 5. 位点特异的重组 (site-specific recombination)

发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination) ，又称基本重组。 是最基本的 DNA 重组方式，通过链的断裂和 再连接，在两个 DNA 分子同源序列间进行单 链或双链片段的交换。 1. 同源重组 2. 接合作用 (conjugation) 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触 时，质粒 DNA 从一个细胞 ( 细菌 ) 转移至另一细 胞（细菌）的 DNA 转移称为接合作用。

可接合质粒， 如 F 因子 (F factor ) 质粒：细菌染色体外的小型环状双链 DNA 分子 （ p61 ）

3. 转化作用 (transformation, 教材 p75) 定义 通过自动获取或人为地供给外源 DNA ，使细 胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。是 原核生物基因重组的重要方式。 例： 溶菌时，裂解的 DNA 片段被另一细菌摄取

4. 转导作用 (transduction) ， p76 定义 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、 再次感染另一（受体）细胞时，发生在 供体细胞与受体细胞之间的 DNA 转移及 基因重组即为转导作用。 例 ： λ 噬菌体的生活史 溶菌生长途径 （ lysis pathway ） 溶源菌生长途径 （ lysogenic pathway ）

4.3 重组 DNA 技术的步骤 1 、目的基因的分离（筛选）与获取 2 、基因克隆载体的选择与构建（切） 3 、目的基因与载体的拼接（连接） 4 、重组 DNA 分子导入（转）受体细胞 5 、筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子 （转化子） 简言之， “ 分、切、接、转、筛 ”

1. 从细胞中分离 DNA ； 2. 限制酶截取 DNA 片段后并与从 大肠杆菌中分离出的质粒重组， 获得携带外源片段的重组质粒； 3. 重组质粒转化大肠杆菌细胞； 4. 将筛选出的含重组质粒的大肠 杆菌进行扩增，克隆大量外源 DNA 片段； 5. 扩增阳性转化子获得目的基因 表达产物（蛋白质），以克隆 的外源 DNA 制备转基因动物和 转基因植物。

相关概念 DNA 分子克隆（ p88 ） 工具酶 (p70-72) 目的基因 (p54) 克隆载体 理想克隆载体的特性（ p60) 克隆载体的条件（ p63 ）

工具酶 限制性核酸内切酶 DNA 聚合酶 I 逆转录酶 T 4 DNA 连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA 聚合酶（ PCR,p58-59 ）

基因克隆重组 DNA 应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质 （ 同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工 的 DNA) 与载体 DNA 接合成一具有自我复制能力的 DNA 分子 ( 复制子 replicon) ，继而通过转化或转染宿主细胞， 筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获 得大量同一 DNA 分子。也称基因克隆或重组 DNA (recombinant DNA) DNA 克隆

基因工程 —— 实现基因克隆所采用的方法 及相关的工作称基因工程, 又称重组 DNA 工艺学。 目的 ： ① 分离获得某一感兴趣的基因或 DNA 序列 ② 获得感兴趣基因的表达产物 ( 蛋白质 )

 限制性核酸内切酶 RE (restriction endonuclease, RE) 定义： 识别 DNA 的特异序列, 并在识别位点或其周围 切割双链 DNA 的一类内切酶 分类 ：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G+ BamH Ⅰ

Ⅱ类酶识别序列特点 —— 回文结构 切口 切口 ： 平端切口 、 粘端切口 GGATCC CCTAGG 5’5’ 5’5’

BamH Ⅰ GTC CAG G CCTAG GATCC G+ GGATCC CCTAGG Hind Ⅱ GTCGAC CAGCTG GAC CTG+ 平端切口粘端切口

人工接头： 由平端加上新的酶切位点， 再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端 连接。

目的基因 （ objective gene ） 又叫外源基因（ foreign gene ）或靶基因（ target gene ） 概念：是指根据基因工程的目的和设计所需要的某些 DNA 分子片断，它含有一种或几种遗传信息的全套密 码（ code ）, 主要是一些编码蛋白质的结构基因（含有 启动子、编码区和终止子）。 p54 获得途径（直接分离、合成、扩增、文库分离） p56 构建基因组文库、构建 cDNA 文库 PCR 扩增（成分、关键因素、反应周期、应用） 化学合成（用于不易分离的、较小的目的基因） 其他方法（鸟枪法、物理化学法、酶切直接分离法等） （教案 p13 ）

基因载体（克隆载体） p60 定义： 定义： 为携带目的基因，在宿主细胞实现其无性 繁殖、自我复制或表达有意义的蛋白质的 一些 DNA 分子。 常用载体 常用载体： 质粒 DNA 、噬菌体 DNA 、病毒 DNA 载体的三种主要类型： p70 穿梭载体 (shuttle vector)—— 克隆载体 (cloning vector)—— 为使插入的外源 DNA 序列（目的基因）被扩增而特意设计的载体。 表达载体 (expression vector)—— 为使插入的外源 DNA 序列（目的基因）可转录翻译成多肽链而特意 设计的载体.

载体的选择标准（条件） p70 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛 选和鉴定； 有克隆位点（外源 DNA 插入点），常具有多个 单一酶切位点，称为多克隆位点； 安全性 分子量小，以容纳较大的外源 DNA 。

常用的克隆载体 质粒 (plasmid)— 存在于细菌染色体外的小型环状双 链 DNA 分子 理想的质粒 分子量小、多拷贝、松弛控制型； 具有多个限制酶的单一切点，即多克隆位点 (multiple cloning sites,MCS) 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青 霉素基因 (Ap r 或 amp r ) 、抗四环素基因 (tet r 或 Tc r ) ； β - 半乳糖苷酶基因 (lac Z) 筛选标志 能插入较大的目的基因（外源 DNA ）

常用的克隆载体 λ 噬菌体 (λphage) p65 特点（线性、 cos 位点、温和、酶切点多） 粘性质粒 (cosmid) ： λDNA 的 cos 区 + 质粒， 双链环状 DNA ，克隆容量： 40~50kb 其他（引导提示，了解）

cos:cohesive-end site 特点： 环形双链 DNA 分子； 质粒和噬菌 体性质。 广泛用于构 建基因组文 库。

重组 DNA 导入受体菌： 受体菌条件 : 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 导入方式： (P75-79 涉及了 10 种方式，从物理、化学、生物等 层面指导理解，并板书讲解和总结 ) 转化 (transformation) 转导 (transduction) 化学刺激， etc

直接选择法： 抗药性标记筛选、插入失活法 筛选、显色互补筛选、核酸分子杂交法（原位 杂交 Southern 印迹等） 非直接选择法： 免疫学方法 （ 如免疫化 学方法、 酶免检测法）、电泳技术、酶切分析、 营养缺陷性等 重组体的筛选

原位 杂交

4.4 基因工程 内涵 基因工程 ( genetic engineering) 、基因克隆、 DNA 重组、 DNA 克隆、分子克隆 克隆（ clone ） 无性繁殖 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA 结合成一具有自我复制能力的 DNA 分子 （复制子、重组体），继而通过转化或转染宿 主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞， 再进行扩增、提取获得大量同一 DNA 分子拷 贝，或其表达产物。

基因克隆示意图

基因工程大事记 1973 S.cohen 第一例成功的克隆实验 1978 Genetech 公司, 重组人胰岛素 ( 第 1 基因工程蛋白药物 ) 1982 重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 ( 转基因鱼 ) 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 中国获准加入 HGP ，负责测定 1% 科学家公布人类基因组工作草图 公布人类基因组基本信息 …… 胰岛素、人生长激素、干扰素、白细胞介素 2 、粒细胞集落刺 激因、子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素 EPO 、 组织纤溶酶原激活剂、生长激素、促生长素、抗血友病因子 Ⅷ、脱氧核糖核酸酶、葡糖脑苷脂酶、鼠单克隆抗体

基因工程的分类 基因工程应用（指导自学） 今日打盹，就会做梦； 今日学习，就会圆梦！ 小事情 能享受小事情的人是有福的：平常的美、 田野的阳光、枝头的鸟、早饭、午饭、晚 饭、门口的报纸、路过的朋友、日常的小 事等等 。 因此，那到远处寻找快乐的人，是把欢乐 遗忘在家里。