藻类生长抑制实验
四、实验步骤 三、实验材料与方法 二、实验原理 一、实验目的与内容 主要内容 五、实验结果 六、注意事项 七、讨论与思考
实验目的与内容 一、实验目的 1. 了解藻类的生长规律； 2. 掌握藻类的培养方法； 3. 掌握化学物质对单细胞绿藻生长影响的 评 价方法。
二、实验内容 1. 运用毒理学实验方法，观察藻类在含有化学污 染物的水环境中的生长抑制情况； 2. 求出受试化合物对藻类生长抑制的 EC 50 ； 3. 阐明受试化合物的剂量－效应关系与生长抑制 特征。
单细胞藻类个体小、世代时间短，是水体中的初级生产者。 因为可在短期内获得化学物质对其许多世代及种群水平上的影 响，所以利用污染物对藻类生长的抑制作用，能反映污染物水 平对水体中的初级生产者的作用情况。 通过将不同浓度的受试物加到属于对数生长期的藻类中，在 规定的实验条件下继续培养，每隔 24 h 测定藻类种群的浓度或 生物量，以观察受试物对藻类生长的抑制作用。经方差分析或 t 检验，显著低于对照 (P < 0.05) 的生长率表明藻类生长受到抑制。 实验原理
实验仪器与试剂 1. 受试物 研究藻类生长抑制实验的受试物应当是挥发性低、环境稳定 性好且可溶于水的物质。如果需要助溶剂，它在水中的浓度不能 超过 0.1 mL/L 。 2. 藻种 斜生栅藻 (Scenedesmus obliquus) 或蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa) 。 3. 培养基 藻类的培养基很多，其成分和浓度各不相同，小球藻和栅藻 可用 “ 水生 4 号 ” 培养基培养。
配制培养基时可将营养盐类按所需浓度直接加入无菌蒸馏 水或去离子水中。应按顺序逐个加入，待一种盐类完全溶解后 再加另一种。亦可先配制各种营养盐类的浓度储液，经灭菌后 避光冷藏保存。当需要配制营养基时，将一定量的浓储备液摇 匀，依次加入到蒸馏水或去离子水中即可。
表 1 水生 4 号小球藻和栅藻培养基 营养盐 含量 (mg) 营养盐 含量 (mL) (NH 4 ) 2 SO FeCl 3 (1%) Ca(H 2 PO 4 ) 2 ∙H 2 O 土壤浸出液 * NaHCO 水 1000 KCl MgSO 4 ∙7H 2 O * 取少量菜园土，加 2 – 3 倍自来水，煮沸 10 余分钟，冷却后用滤纸 过滤即可使用。
4. 实验器材 电子天平 (2 台 ) 、立式压力蒸汽灭菌器 (2 台 ) 、无菌操作台 (4 台 ) 、显微镜 (4 台 ) 、生化培养箱 (2 台 ) 、 pH 计 (4 套 ) 、气浴恒温摇 床 (4 台 ) 、可见分光光度计 (4 台 ) 、数字照度计 (2 台 ) 、血球计 (4 套 ) 、血小球记数板 (200 块 ) 、 4 到 7 只 30W 的普通白色荧光灯、 ф60 漏斗 (4 个 ) 、锥形瓶、温度计、滤纸和纱布等若干。 5. 实验药品 硫酸铵、磷酸二氢钙、碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯 化铁均为分析纯，土壤浸出液。
实验步骤 1. 藻类培养 培养温度为： 24±2 ℃；白色荧光灯均匀光照，光照强度为 4000±400 lux ，连续光照或以 12 ： 12 或 14 ： 10 光暗比光照；机 械震荡 (100±10 次 /min) ；培养容器用棉塞、滤纸、纱布 (2~3 层 ) 或锡箔纸等封闭，对挥发性化学物质采用磨口玻璃瓶塞完全封 闭。 可根据实验需要选择容量不同的实验容器， 125 mL 锥形瓶 中测试液的体积为 mL ； 250 mL 锥形瓶中测试液体积为 mL ； 500 mL 锥形瓶中测试液的体积为 mL 。
2. 藻试液的配制 从储备液中取出一定的藻液，接种到新鲜的无菌培养液中， 接种浓度约为 104 个 /mL 。在与试验要求相同的条件下进行预 培养，要求在 2–3 天内藻类能达到对数生长，然后再次转移到 新鲜的培养液中。如此反复转接培养 2–3 次，藻类生长健壮并 开始处于对数生长期时即可用来制备实验中需要的藻类试验 液。
3. 受试物试验液的配制 根据初步试验确定产生效应的浓度范围，至少设置五个构 成对数间距系列的浓度，浓度比不超过 2.2 。最低测定的浓度 必须对海藻生长没有影响。最高测定浓度必须抑制相对对照 实验至少 50% 的绿藻生长，最好使绿藻生长完全停止。至少 设置 3 个平行样，每一系列设一个对照。实验前应测定受试液 的 pH ，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液将 pH 调到 7.5±0.2 。试验 结束时应测定被测物质的实际浓度。
4. 测试液的配制 先在每个试验锥形瓶中加入 50mL 藻液，再加 50mL 受试物 溶液。对照组只加 50mL 培养液。将各瓶摇动混匀后，放入光 照培养箱中培养。实验开始后，每隔 24h( 即在 24 ， 48h) 测定 各组藻类的细胞密度。
1. 藻类生长的测定 藻类生长是指在试验期间每毫升溶液中藻类细胞 数目的增加量。一般用以下三种方法测定藻类的生 长：①细胞计数；②测光密度；③测叶绿素含量。 推荐使用方法①和②。 实验结果
2. 数据处理 将不同浓度试验培养液和对照培养液的藻细胞浓度与测 试时间绘制成曲线图，再用下面方法确定浓度效应关系。 生长率是单位时间内 (tn-t1) 藻类细胞增长的量 (Nn-Nt) 。 对数生长期的藻类平均特定生长率可用下式计算： （ 1 ）
式中： μ—— 藻类平均生长率； t—— 培养时间， t1 为起始时间， tn 为终了时间； N—— 藻类细胞生长量， N1 为起始细胞数， Nn 为 最终细胞数。 以不同浓度组中藻类生长率的下降比例与对数浓度作图， 可直接从图上读出 EC 50 ，再标明测定时间，如 24 h EC 50 。也 可求出回归关系式，再算出 EC 50 。
表 2 实验记录表格 时间 藻类平均 生长率 对照浓度 1 浓度 2 浓度 3 浓度 4 浓度 5 24 h 48 h 根据直线内插法或概率单位图解法估算 24h 和 48h 藻类生长 受到抑制的 EC 50 。
注意事项 1. 在正式试验前必须进行必要的预试验。 2. 实验藻种的选择和预培养应注意：藻细胞大小均匀，颜色 鲜绿，处于对数生长期。试验开始 3 天内，对照组藻细胞浓 度至少应增加 16 倍。 3. 需要明确受试化合物的理化特性，有针对性的进行实验。
1. 干扰藻类 EC50 正常测定的因素有哪些？ 2. 受试物质对藻类的生长在不同时期起的作用 有何 不同？有无促进作用？ 思考与讨论