ESPECTROFOTOMETRIA 1 5 de Junho de 2017

O espectro electromagnético 2

Conceitos básicos sobre ondas e cor 3 uma oscilação c.d.o. Frequência = 1 oscilação por segundo Amplitude da onda (potência)

Conceitos básicos sobre ondas e cor 4

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Lei de Lambert-Beer A quantidade de radiação absorvida pode ser calculada de diferentes maneiras, Transmitância ou Absorvância: Transmitância, T = I/I 0 T(%) = 100 x T Absorvância, A = log 10 I 0 /I A = log 10 1/T 8

Lei de Lambert-Beer A lei de Lambert-Beer pode ser expressa pela equação: A = εlc A – é a absorbância (adimensional, A = log 10 P 0 /P), ε – absortividade molar ou coeficiente de extinção molar (L mol -1 cm -1 ) l – comprimento do trajeto ótico c – concentração do analito na solução (mol L -1 ) 9

Lei de Lambert-Beer Por que se usa a Absorvância ao invés da Transmitância em análises quantitativas? 10

Espectrofotómetro 11

Espectrofotometria 12

Espectrofotómetro 13 Abs = ε l c

Concentração da Biomolécula Absorvância ( c.d.o. fixo) Biomolécula + Corante ↓ Produto

15 Padrões da Substância S 1 – 0,0 mg/mL 2 – 0,2 mg/mL 3 – 0,4 mg/mL 4 – 0,6 mg/mL 5 – 0,8 mg/mL Para quantificar uma substância 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 mg/mL Abs Recta padrão [S] = 0,31 mg/mL Valores de Abs para Padrões de S 1 – 0,010 2 – 0,023 3 – 0,037 4 – 0,051 5 – 0,068 Curva de calibração 0,034 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 mg/mL Abs Absorvância S = 0,034

Absorvância ( c.d.o. fixo) Biomolécula + Corante ↓ Produto P.: Qual a concentração de uma amostra com 0,5 Abs? Limite de deteção mg/ dL

mg/ dL Absorvância ( c.d.o. fixo) Biomolécula + Corante ↓ Produto O limite de detecção é 2 mg/dL Limite de deteção

III. Materiais e reagentes: 18 Materiais e EquipamentosReagentes  Goblés  Pipetas graduadas  Provetas graduadas  Micropipetas  Microplacas  Pontas estéreis  Espectrofotómetro  Leitor de microplacas  Banho maria a 100 ºC  Vórtex  BSA (5mg/mL)  BSA (1mg/mL)  Água destilada  Reagente de Bradford

Procedimento experimental Parte 1: Determinação do espectro de absorção do complexo Albumina- Bradford 1.Coloque 50 µL de uma solução a 5 mg/mL de B.S.A (albumina) e junte 50 µL de água destilada num tubo de ensaio; 2.Homogeneíze bem no vórtex. 3.Prepare outro tubo de ensaio com 100 µL de água destilada; 4.Adicione 3 mL de reagente de Bradford (azul Coomassie) a cada tubo e deixe passar 5 minutos; 5.Regule o espectrofotómetro para 400 nm. Acerte o zero com a solução de BSA de concentração 0 mg/mL – Branco. Leia a absorvância de cada solução preparada no ponto 1. 6.Anote o valor. 7.Continuar as medições em intervalos de 15 nm até um comprimento de onda de 700 nm. Atenção: não esquecer de calibrar o aparelho com o tubo branco para cada novo valor de comprimento de onda. 19

Procedimento experimental Parte 2: Construção de uma recta padrão para proteínas 1.Pipete, para tubos devidamente marcados, as seguintes reagente nas quantidades (em mL) indicadas na tabela seguinte: 2.Homogeneíze bem no vórtex. 3.Adicione 3 mL de reagente de Bradford (azul Coomassie) e deixe passar 5 minutos. 4.Regule o espectrofotómetro para 595 nm. Acerte o zero com a solução de BSA de concentração 0 mg/mL – Branco. Leia a absorvância de cada solução preparada no ponto TUBO (mg/mL) 00,10,20,30,40,513 BSA 1 mg/mL BSA 5 mg/mL H2OH2O