1. 实 验 十
细菌生化实验

2. 一、实验目的
1、证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。
3、了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。
4、掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5、了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。

3. 二、实验原理
1、微生物对生物大分子的分解利用
淀粉水解：淀粉酶
油脂水解：脂肪酶
明胶液化：蛋白酶
石蕊牛乳试验：产酸、产碱、胨化、酸凝固等。
2、糖发酵试验
产酸：溴甲酚紫指示剂
大肠杆菌：
产气肠杆菌：
产气：杜氏小管检测
3、IMViC试验

4. IMViC试验 吲哚试验： 甲基红试验（M.R.试验）： 伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验）：
柠檬酸盐试验：
色氨酸酶：色氨酸→吲哚＋对二甲基氨基苯甲醛→玫瑰吲哚（红色）
大肠杆菌：
产气肠杆菌：
产酸能力：强，甲基红变红；弱：甲基红不变色
大肠杆菌：阳性
产气肠杆菌：阴性
葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→2,3-丁二醇
乙酰甲基甲醇→OH－→二乙酰＋精氨酸的胍基→红色化合物
大肠杆菌：阳性
产气肠杆菌：阴性
能否利用柠檬酸作为碳源
大肠杆菌：阴性
产气肠杆菌：阳性

5. 三、实验材料
1、菌种：枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），普通变形杆菌（Proteus vularis），产气肠杆菌。
2、培养基：固体油脂培养基，固体淀粉培养基，明胶培养基试管，石蕊牛奶试管，尿素琼脂试管、葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支，普通变形杆菌（内装有倒置的德汉氏小管） ，蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基。
3、溶液或试剂：革兰氏染色用卢氏碘液（Lugol’s iodine solution），甲基红指示剂，40% KOH，5% α-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。
4、仪器或其他用具：无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架。

6. 四、实验步骤
1、细菌水解大分子物质试验
淀粉水解试验
油脂水解试验
培养基：淀粉培养基平板
菌种：大肠杆菌和枯草芽孢杆菌
方法：平板上划“十”字接种
注意：接种前在平板底部作记号；“十”字不要太大
明胶液化试验
培养基：油脂培养基平板
菌种：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌
方法：平板上划折线接种
注意：接种前在平板底部作记号
石蕊牛乳试验
培养基：试管明胶培养基
菌种：大肠杆菌或 产气肠杆菌
方法：穿刺接种
注意：20℃培养
培养基：试管石蕊牛乳培养基（2支）
菌种：粘乳产碱菌或铜绿假单胞菌
方法：斜面划线接种
注意：观察结构注意牛乳产酸、产碱、凝固、胨化现象是连续出现的。

7. 四、实验步骤
1、细菌水解大分子物质试验
2、糖发酵试验
培养基：葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基（内装杜氏小管）（各3支）
菌种：大肠杆菌和产气肠杆菌
方法：分别接种于葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基

8. 四、实验步骤
1、细菌水解大分子物质试验
2、糖发酵试验
3、IMViC试验

9. IMViC试验 试验名称 培养基名称 菌种名称 接种方式 接种 管数 吲哚试验 蛋白胨水培养基 大肠杆菌和产气肠杆菌 液体 1 甲基红试验
葡萄糖蛋白胨培养基
伏普试验
柠檬酸盐试验
柠檬酸盐培养基 斜面

10. 五、实验报告
1、分别记录试验菌种对淀粉水解、脂肪水解、明胶液化、石蕊牛奶及尿素试验的结果。以“＋”表示阳性，“－”表示阴性。
2、记录大肠杆菌及普通变形杆菌对葡萄糖和乳糖的发酵试验结果。以“+”表示产酸或产气，“－”表示不产酸或不产气。
3、记录大肠杆菌和产气杆菌的吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验、柠檬酸盐试验及硫化氢试验结果，以“+”表示阳性反应。“－”表示阴性反应。
4、不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？

11. 五、实验报告
5、假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
6、为什么大肠杆菌的甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏－普试验最初底物与最终产物有何异同之处？
7、说明在硫化氢试验中醋酸铅的作用，可以用哪种化合物代替醋酸铅？