1. Isolation and characterization of organism producing thermo- stable lipase 報告學生 : 莫曉嬌 宋志潔 報告日期 :2003/12/29

2. 前言  Lipase ( 脂肪分解酵素 ) 可用作分解脂肪  環境中有許多微生物可產生 lipases ，催化 triglycerol 分解成 glycerol 與 fatty acid  微生物所產生的 lipase 多為胞外酵素  Lipase 多為適中溫酵素

3.  Lipase 有許多用途： 1. 食品工業：起士 2. 清潔劑工業 3. 油脂工業：甘油 4. 廢水處裡 5. 醫療：吸收不良病患  Thermostable lipase ： 1. 嗜高溫微生物 2. 一般溫度生長之微生物

4. 目的 從環境中採集樣本，希望能找出並分離﹑ 鑑定能產生 thermostable lipase 的微生物。

5. 實驗架構 Tributyrin agar plate ：分離 不同受質培養基 +Rhodamin B 堆肥：篩菌 生化測試：鑑定

6. 材料  培養基 1.Tributyrin agar plate (per L) ： Peptone 5.0g Beef extract 3.0g Agar 25.0g Tributyrin 15.0g 2. 不同受質培養基： Peptone 5.0g Beef extract 3.0g Agar 25.0g Olive oil ﹑ Corn oil ﹑ Pig oil ﹑ Tween20 10.0g/L Rhodamin B 10.0ml/L

7. 3. 生化測試培養基： NA+NaCl ﹑ Nitrate broth ﹑ SIM ﹑ MR-VP broth ﹑ Phenol red+sugar broth ﹑ MSA ﹑ Citrate ﹑ Urea broth  樣本： 木柵動物園之堆肥  0.85% NaCl 無菌生理實驗水

8. 實驗流程  培養和分離 1g 樣本 +9mL 0.85% NaCl ↓ 取 0.1ml 之 10 1 ﹑ 10 2 ﹑ 10 3 ﹑ 10 4 ﹑ 10 5 稀釋度塗抹平 板，在 Tributyrin agar plate ↓ 50 ℃培養 1-3 天 ↓ 觀察有無生長與透明環產生 ↓

9. 選擇有透明環之菌落，在 Tributyrin agar plate 上作純培養， 50 ℃培養 1-3 天 ↓ 在 Tributyrin agar plate 上作繼代培養， 50 ℃與 60 ℃培養 1-3 天 ↓ 培養於 Tributyrin plate ﹑ Olive oil plate ﹑ Corn oil plate ﹑ Tween20 plate ﹑ Pig oil plate ， 50 ℃與 55 ℃培養 1-3 天 ↓ 觀察有無生長與透明環產生 ↓

10. 培養於 Tributyrin plate ﹑含有 Rhodamin B 的 Olive oil plate ﹑ Corn oil plate ﹑ Tween20 plate ﹑ Pig oil plate ， 50 ℃與 55 ℃培養 1-3 天 ↓ 觀察有無生長與透明環及螢光產生 ↓ 鑑定

11.  鑑定 Gram stain ： G(+) rods ( 圖二 ) ( 圖二 ) Spore stain ( 圖四, 圖五 ) 圖四 圖五 Glucose fermentation 1B, 1C,1D, 1E, 1F, 2A (Bacillus sp.) Catalase +- +- + - Sporosacina sp. Clostridium sp. Desulfotomaculum sp. + - Motile +- Lactobacillus sp. Erysipelothrix sp. 2D (Brochothrix) Listeria sp. Kurthia sp.

12. 1B, 1C,1D, 1E, 1F, 2A(Bacillus sp.) 60 ℃生長 +- 1C, 1E (B. stearothermophilus) 10%NaCl 生長 +- 1D (B. pantothenticus) 1B, 1F, 2A (B. megaterium)

13.  鑑定 ( 續 ) Gram stain: G(+) cocci Catalase +- Oxidase Streptococcus sp. +- Micrococcus sp. Motile +- 2E (Planococcus sp.) Staphylococcus sp. Stomatococcus sp.

14. 結果

17. 討論  鑑定的結果之正確性，原因是 : 1. 有很多生化測試是 d 或 ND 2. 所作的生化測試並不完全 3. 測得的結果很類似 4. 部分菌株特性 Bergey’s manual 中没列  改善上述缺點的方法 : 1. 操作技術純熟 2. 用 Biolog 分析

18.  生化測試之糖類發酵 : 糖類改為過濾滅菌應可改善結果之判讀  培養條件 : 1. 培養基受質選擇 : (1) 受質結構的不同 (2) 受質濃度用量 2. 培養溫度之選擇

19. 參考文獻 Rohit Sharma, and Yusuf Chisti. 2001. Production, purification, characterization, and applications of lipase. Biotechnol Advances.19:627-662. Yougxiang Wang. 1995. Thermostable alkaline lipase from a newly isolated thermophilic Bacillus Strain A30-1 (ATCC 53841). J Fermen Bioeng. 79:433-438. 謝汎擎. 2001. 耐熱脂肪分解酵素分離與特性測定. Bergey’s manual. Vol. 2.

20. 圖一､木柵動物園堆肥樣本

21. 圖二､革蘭氏陽性桿菌 (1B)

22. 圖三､革蘭氏陽性球菌 (2E)

23. 圖四､孢子染色結果 (1D)

24. 圖五､孢子染色結果 (1F)

25. 圖六. 2D 菌在 Tributyrin plate 產生的透明環

26. 圖七､ 2E 菌在 olive oil plate 上產生的透明環

27. 圖八､ 2E 菌在 Pig oil plate 上產生螢光