生科4甲 蔡德峰

前言 sequencing of the human -> functional genomics Gene-expression microarrays and RNA interferences (RNAi) ATM/NFκB and ATM/p53-mediated arms

functional genomics to gaining system-level understanding of the mechanisms gene products interact and regulate each other physiological processes during normal development and in response to homeostatic challenges 知道基因的序列只是了解基因功能的第一個步驟，而細胞或生物體的調節、發育、生長、分化、遺傳與行為乃至疾病的發生和病理變化等錯綜複雜的現象，不僅受到基因編譯之核醣核酸及蛋白質所支配，也受到基因的表達和交互作用所主宰。故人類基因的表現和其交互作用實與各種生命現象有著密切的關聯。

Gene-expression microarrays Affymetrix GeneChip Technology Description The researcher provides total RNA samples to the VBI CLF for processing. All RNA samples entering the VBI CLF are assayed on the Agilent 2100 BioAnalyzer for a rapid quantitative and qualitative assessment. Samples that pass this initial quality control check are then processed as described below. Figure 1. Standard eukaryotic gene expression assay. The basic concept behind the use of GeneChip arrays for gene expression is simple: labeled cDNA or cRNA targets derived from the mRNA of an experimental sample are hybridized to nucleic acid probes attached to the solid support. By monitoring the amount of label associated with each DNA location, it is possible to infer the abundance of each mRNA species represented. Although hybridization has been used for decades to detect and quantify nucleic acids, the combination of the miniaturization of the technology and the large and growing amounts of sequence information, have enormously expanded the scale at which gene expression can be studied. https://www.vbi.vt.edu/ article/articleview/145

RNA interferences (RNAi) (RNA-induced silencing complex) 1.RNAi：（RNA interference）RNA干擾 一些小的雙鏈RNA可以高效、特異的阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi，也譯作RNA干預或者干涉）。它也是體內抵御外在感染的一種重要保護機制。 2.siRNA：(small interfering RNAs)小干擾RNA 一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。 3.shRNAs:(RNA-Short hairpin RNAs)短發夾RNA 是設計為能夠形成發夾結構的非編碼小RNA分子，短發夾RNA能夠通過RNA干擾來抑制基因的表達。Thomas Rosenquist‘s group和Greg Hannon’s group聯合研究了在哺乳動物種系細胞中shRNAs的轉移導致基因長時間穩定沉默的機制。 10.RISC：（RNA-induced silencing complex）RNA誘導沉默復合物 在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物。激活RISC需要一個ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3‘端12個堿基的位置切割mRNA(3, 18, 27, 29)。盡管切割的精確機制現在還是未知，研究表明每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。 11.Dicer：Dicer酶 RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，能以一種ATP依賴的方式逐步（processive）切割由外源導入或者由轉基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19—21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片斷的3'端都有2個堿基突出(27, 28) 14.gene silence:基因沉默 研究結果發現有大量的轉基因植株不能正常表達，通常這并不是由于轉基因的缺失或突變引起的，而是基因失活的結果.這種失活的現象稱為基因沉默。 www.mpg.de/.../ EEB/200432_035.shtml

RNA interferences (RNAi) www.life.uiuc.edu/ shapiro/RNAiApps.html

ATM/p53 -mediated ATM/NFkB -mediated G1 checkpoint P53蛋白是一種重要的腫瘤抑制因子，作為轉錄因子在轉錄網絡之中發揮核心作用。在細胞受到刺激時P53被激活進而調控其下游基因轉錄，通過下游基因的表達來調控其原始的細胞周期檢查點、DNA損傷修復、細胞凋亡等生物學功能。 ATM/p53 -mediated ATM/NFkB -mediated Ataxia- telangiectasia ( AT) www.biocarta.com/ pathfiles/m_atmPathway.asp

www.mbb.yale.edu/ fl/fl_s_ghosh.htm 四、NF-κB信號途徑 NF-κB是屬于Rel家族的轉錄因子，參與調節與機體免疫、炎癥反應、細胞分化有關的基因轉錄。哺乳動物細胞中有五種NF-κB/Rel：RelA(P65)，RelB，C-Rel，NF-κB1(P50)、NF-κB2(P52)，都具有Rel同源區(Rel homology domain，RHD)，能形成同或異二聚體，啟動不同的基因轉錄。靜息狀態下，NF-κB二聚體與抑制蛋白IκB結合成三聚體而被隱蔽于細胞質，胞外刺激可激活IκB的泛素化降解途徑，而使NF–κB二聚體進入胞核，調節基因轉錄。 IκB家族成員有IκBα，IκBβ，IκBγ，IκBδ，IκBε，Bcl-3等，都具有與Rel蛋白相互作用的錨蛋白重復序列和與降解有關的C端PEST序列。 IKK(IκB kinases)是NF-κB信號傳導通路的關鍵性激酶。胞外信號如：腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF）、白介素1(interleukin-1，IL-1)等可以激活IKK，使IκB磷酸化，隨后被泛素化途徑降解。 NFkB ATM/NFkB -mediated www.mbb.yale.edu/ fl/fl_s_ghosh.htm

ATM NFkB ATM/NFkB -mediated http://www.emdbiosciences.com/popup/cbc/NFKB_Interactive_Pathway.htm

Hypothesis the combined experimental strategy of expression arrays and RNAi is indeed a powerful method for the dissection of complex transcriptional networks, and that computational promoter analysis can provide a strong complementary means for assessing the accuracy of this dissection.

實驗流程圖 TRANSFAC Microarray analysis Definition of the damage-responding gene set Microarray analysis 建立siRNA knocked-down cellular systems Computational promoter analysis GO functional gene annotations Cluster analysis TRANSFAC * * *- New candidate target genes * * Database search * Adapted from Thomas Werner Biomolecular Engineering, 17: 87-94 (2001)

建立siRNA knocked-down cellular systems Materials and methods DNA fragments To be cloned pSUPER retroviral vector To be transfected HEK293 cell (哺乳動物) 4. siRNA表達載體 多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數月的時間，同時也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的。 siRNA表達載體的優點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。 病毒載體也可用于siRNA表達，其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩定。 最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。 不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。 較少數量的dsRNA卻能使大量的靶mRNA沉默，這種現象的產生至少包含三種擴增放大機制： 1) 長的dsRNA被Dicer酶裂解成的每個 siRNA （又叫初級siRNA），都具有結合一個同源mRNA的能力，故放大水平取決于dsRNA的長度。此步放大效應約10-20倍。 2)在細胞內還存在有一種RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-directed RNA polymerase,RdRP）。在RISC復合物中，以siRNA的單鏈作為引物，以mRNA為模板，在RdRP酶的作用下，合成出mRNA的互補鏈，發生了類似于PCR的反應，結果mRNA也形成了dsRNA。隨后dsRNA再被Dicer酶裂解成新的siRNA(又叫次級siRNA)。通過這種聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA數量大大增加，顯著增強了對基因表達的抑制作用。 3)以上生成的siRNA可多次重復應用，進一步提高了其放大作用。 從21-23個核苷酸的siRNA到幾百核苷酸的雙鏈RNA都能誘發RNAi，顯然，長的雙鏈RNA阻斷基因的效果要明顯強于短的雙鏈RNA即siRNA。 (selected with puromycin or hygromycin) 病毒載體用于siRNA表達，其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩定。 最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。

以Western blotting 檢驗 RNAi siRNA實驗成功要點 1. 對每個基因設計并檢測兩到四個siRNA序列 為了找到潛在靶位點，掃描靶基因中的AA序列。記錄每個AA 3’端19個核苷酸作為潛在siRNA靶位點。潛在靶位點需通過GENBANK數據庫的BLAST分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點。如果可能，siRNA應根據mRNA低二級結構的區域設計。美國著名RNA產品公司Ambion提供網上在線設計工具，幫助您更快地完成這項工作。網址為：www.ambion.com/techlib/misc/ siRNA_finder.html 2. 選擇低GC含量的siRNA Ambion公司研究發現GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。 3. 純化體外轉錄siRNA 在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫（Ambion siRNA體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA純度）或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。 4. 避免RNA酶污染 微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。Ambion公司在這方面有一整套的產品線，如除RNA酶的噴劑，拭紙及液劑，檢測和去除RNA酶。 5. 健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性 通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。 6. 避免適用抗生素 Ambion公司推薦從細胞種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。QIAGEN推出的專門針對RNA轉染的試劑 7. 選擇好的轉染試劑轉染siRNA 針對靶細胞類型，選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。siRNA實驗要求選擇適合轉小的RNA的轉染試劑（目前大多數轉染試劑都針對轉染比較大的質粒DNA，而非小的RNA分子，宿主范圍大小也不同）。Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是專門針對轉siRNA優化的轉染試劑，是您的理想選擇。 8. 通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件 對大多數細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多種靶基因的陽性siRNA。 9. 通過陰性對照siRNA排除非特異性影響 合適的陰性對照可通過打亂活性siRNA的核苷酸順序設計而得。必須注意它要進行同源比較確保相對所要研究的生物的基因組沒有同源性。 10. 通過標記siRNA來優化實驗 熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。 RNAi并不能完全阻斷基因的表達，特別是表達異常高的基因。

Sample preparation and microarray hybridization Materials and methods isolated using TRIzol reagent treated with DNase I phenol/chloroform extracted ethanol-precipitated and quantitated. RNA HEK293 cell (4 h with 200 ng/ml of NCS.) Affymetrix Human Focus Gene- Chip arrays 10 種狀態 : five cellular systems (uninfected and the LacZ control cells and cells knocked-down for Rel-A, p53 and ATM), each probed at two time points: without treatment and 4 h after exposure to NCS. (All samples were probed in independent triplicates)

Computation of gene expression levels from microarray signals Materials and methods RMA method 1. RMA 計算後, 信號明顯增強 2. RMA 使用齊次多項式證明數據改進更好

Definition of the damage-responding gene set Materials and methods DMA method 取數值at least 1.5-fold in one control (either the uninfected or the LacZ-infected cells), and at least 1.4-fold in the same direction in the other control. A total of 112 genes that were induced in both controls met this criterion and are referred to as the damage-induced gene set. Only seven genes met an analogous criterion for repression in response to NCS treatment

Cluster analysis Materials and methods 112 gene 使用 the EXPANDER package 去做 average-linkage hierarchical clustering

GO functional gene annotations Materials and methods The gene ontology (GO) annotations Computational promoter analysis Materials and methods PRIMA software

Quantitative real-time RT-PCR Materials and methods real-time PCR Five micrograms of total RNA cDNA oligo(dT) SuperScript II RNase H- reverse transcriptase

討論 RNAi and microarray technologies and a recently developed computational tool are powerful off-target effects computational promoter analysis was highly enriched for the binding signature of ATF2/ATF3/Jun

結論 RNAi, microarrays and computational promoter analysis 對於 dissection of transcriptional networks 的研究是有力的 Targeting the primary activator of a DNA damage response network, the upstream regulator(ATM) was indeed required for the induction of much of the network, the two downstream regulators (p53/NFkB)mediated the activation of largely disjoint sets of genes Statistical tests 聯合 computational promoter analysis 是高精確的