1. Isolation and Characterization of Bacteria which Tolerate High pH ( ＞ 10) and Produce Protease 報告學生： 林沛穎、 譚皓仁 報告學生： 林沛穎、 譚皓仁 報告日期： 2003. 12.29 報告日期： 2003. 12.29

2. 前言 Alkaliphile ：能生長在 pH 值＞ 9 ，但無法生長於 pH 值＜ 6.5 的微生物 Alkaliphile ：能生長在 pH 值＞ 9 ，但無法生長於 pH 值＜ 6.5 的微生物 包括： (1) Bacillus species, Micrococcus species, 包括： (1) Bacillus species, Micrococcus species, Pseudomonas species, Streptomyces species Pseudomonas species, Streptomyces species (2) 酵母菌 (2) 酵母菌 (3) 真菌 (3) 真菌

3. Alkaliphile 較容易從鹼性環境中分離出來，但也可從一般 土壤中找到 Alkaliphile 較容易從鹼性環境中分離出來，但也可從一般 土壤中找到

4. Alkaliphiles 的應用： 大多用於應用工業 大多用於應用工業 其所產生的 alkaline cellulase 或 alkaline protease 可作為 生物清潔劑 其所產生的 alkaline cellulase 或 alkaline protease 可作為 生物清潔劑

5. 細菌的 alkaline protease 的特質為： (1) 在高 pH 值（ e.g,10 ）具有高度活性 (2) 廣泛的受質專一性 (3) 最佳的作用溫度為 60 ℃

6. 實驗目的 從環境中分離出耐鹼且會產生 protease 的微生物

7. 實 驗 步 驟 分離耐鹼菌 分離耐鹼菌 以鹼性培養基作分離 以鹼性培養基作分離 檢測是否會產 protease 檢測是否會產 protease 以 skim milk agar 培養 觀察菌落周圍有無透明環 以 skim milk agar 培養 觀察菌落周圍有無透明環 將 skim milk agar 上的菌落再接到鹼性培養基作確認 將 skim milk agar 上的菌落再接到鹼性培養基作確認

8. Alkaline medium 的成分 (g / L) ： Glucose / Soluble starch………………………….10g Glucose / Soluble starch………………………….10g Yeast extract……………………………………….5g Yeast extract……………………………………….5g Peptone……………………………………………..5g Peptone……………………………………………..5g K 2 HPO 4 …………………………………………….1g K 2 HPO 4 …………………………………………….1g MgSO 4 · 7H 2 O…………………………………...0.2g MgSO 4 · 7H 2 O…………………………………...0.2g Na 2 CO 3 ……………………………………………10g Na 2 CO 3 ……………………………………………10g Agar………………………………………………..20g Agar………………………………………………..20g

9. Skim milk agar 的成分 (g / L) ： Skim milk powder………………………………..10g Skim milk powder………………………………..10g Yeast extract…………………………….…………1g Yeast extract…………………………….…………1g Agar……………………………………………….15g Agar……………………………………………….15g

10. 結果

13. 分離純化耐鹼菌

17. 檢測是否產生 protease 菌株 (1) 、 (3) 菌落周圍有透明環

18. 菌株 (K) 菌落周圍有透明環

19. 真菌菌落周圍有透明環

20. 革蘭氏染色 菌株 (1)

21. 菌株 (3)

22. 菌株 (K) 菌株 (K)

23. 革蘭氏染色結果 (1)(3)(K) 菌皆為 G(+) 球菌 革蘭氏染色結果 (1)(3)(K) 菌皆為 G(+) 球菌 推測其皆為 Micrococcus spp. 推測其皆為 Micrococcus spp.

24. 討論 要篩耐鹼的細菌並非一定要在很鹼的環境中 要篩耐鹼的細菌並非一定要在很鹼的環境中 細菌在鹼性的環境下生長較慢 細菌在鹼性的環境下生長較慢 有些菌產生的 protease 量可能較少，如 K 菌 有些菌產生的 protease 量可能較少，如 K 菌

25. 參考文獻 Koki Horikoshi, Alkaliphiles: Some Applications of Their Products for Biotechnology, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1999, 63: 735-750 Koki Horikoshi, Alkaliphiles: Some Applications of Their Products for Biotechnology, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1999, 63: 735-750 Mala B. Rao, Aparna M. Tanksale, Mohini S. Ghatge, and Vasanti V. Deshpande, Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62: 597-635 Mala B. Rao, Aparna M. Tanksale, Mohini S. Ghatge, and Vasanti V. Deshpande, Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62: 597-635 Nathalie Wery, Ursula Gerike, Ajay Sharman, Julian B. Chaudhuri, David W. Hough, and Michael J. Danson, Use of a Packed-Column Bioreactor for Isolation of Diverse Protease-Producing Bacteria from Antarctic Soil, Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69:1457-1464 Nathalie Wery, Ursula Gerike, Ajay Sharman, Julian B. Chaudhuri, David W. Hough, and Michael J. Danson, Use of a Packed-Column Bioreactor for Isolation of Diverse Protease-Producing Bacteria from Antarctic Soil, Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69:1457-1464