1. 实验 16 油菜的花药培养 了解和学习油菜花药培养技术。 一、目的

2. 实验 16 油菜的花药培养 油菜花药培养是获得单倍体的重要途径。如果利用 杂种一代的花药培养，可将杂种一代的异质配子培育成 单倍体小植株，经染色体加倍形成双单倍体纯合个体， 经选择可以获得优异的材料，从而可缩短育种周期，提 高育种效果。此外，花药培养可克服远缘杂种的不育性 ，可以在细胞水平或单倍体水平上作诱变处理，也能提 高育种效果。 二、内容说明

3. 实验 16 油菜的花药培养 油菜花药培养有以下步骤： （ 1 ）花粉发育时期的选择， （ 2 ）诱导花药产生愈伤组织， （ 3 ）诱导愈伤组织进行器官分化， （ 4 ）小植株的移栽，形成花粉植株。 二、内容说明

4. 实验 16 油菜的花药培养 1 、用品：显微镜，培养皿，镊子，记载表。 三、所需用品和操作方法 （一）花粉发育时期的选择

5. 实验 16 油菜的花药培养 操作台操作台操作台操作台

6. 2 、主要作法： 在始花期选择油菜品种（或杂种）生长健壮的植株 ，取其主茎顶端蕾盘（即主花序，因花序未伸长而称蕾 盘）或植株主茎上往下数 5 个第一次分枝顶端的蕾盘 2-3 个。每个蕾盘大致可分为三圈，外圈有 15-25 个花蕾， 中圈有 10-15 个花蕾，内圈即花盘中间的一撮蕾。 据研究，油菜花药培养以取中圈花蕾最适宜，相应 于此时期的花粉时期为单核期至双核期。 （一）花粉发育时期的选择

7. 实验 16 油菜的花药培养

8. 2 、主要作法（续）： 分别取油菜主茎顶端花盘外、中、内圈花蕾 ，用醋酸地衣红或醋酸胭脂红涂抹制片，在显 微镜下观察花粉发育时期，并接种在 Miller 培养 基上，观察不同部位花蕾的花药产生愈伤组织 百分率，填入表 16-1 中。 （一）花粉发育时期的选择

9. 实验 16 油菜的花药培养 2 、主要作法（续）： 表 16-1 不同部位花蕾花粉发育时期和产生愈伤组织百分率 （一）花粉发育时期的选择 取蕾部 位 花粉发育 时期 接种花药 数 愈伤组 织数 产生愈伤组织 百分率 外圈 50 中圈 50 内圈 50

10. 实验 16 油菜的花药培养 1 、用品（见下图）： 镊子，小烧杯，接种针， 75% 酒精，新鲜的饱 和漂白粉上清液或 0.1% 升汞溶液，蒸馏水，无 菌水，超净工作台（或接种箱），酒精灯，各 种有关培养基（见表 16-3 ）， 50ml 三角瓶，培 养室。 （二）诱导花药产生愈伤组织

11. 实验 16 油菜的花药培养 用品

12. 2 、主要作法： （ 1 ）花药的接种。 用肥皂洗净双手，再用 75% 酒精擦洗，然后 用 75% 酒精擦拭花盘，在超净工作台取花蕾浸 入饱和漂白粉上清液或 0.1% 升汞溶液中浸泡 10- 15 分钟，再用无菌水冲洗 2-3 次。 用镊子将花药取出投入装有培养基的三角瓶 中，每三角瓶接种 30 个左右花药。 接种后用棉花塞塞好，用记号笔写上接种材 料、日期。 （二）诱导花药产生愈伤组织

13. 实验 16 油菜的花药培养

14. 2 、主要作法（续）： （ 2 ）愈伤组织的诱导 诱导花药产生愈伤组织用的培养基一般采用 Miller 培 养基 +2 ， 4-D 1mg/L+ 激动素 1.5mg/L 。 将接种到诱导培养基上的花药置于 23-28 ℃的恒温室 内进行暗培养。 接种后 4-5 天花药大部分变成浅棕色或深棕色， 5-10 天开始产生愈伤组织，陆续可延至二个月之久。 观察记载愈伤组织长出的部位和数量。 （二）诱导花药产生愈伤组织

15. 实验 16 油菜的花药培养 1 、用品 MS 培养基， 6 苄基嘌呤，激动素，吲哚乙酸，培 养室，小花钵，无土培养物。 （三） 诱导愈伤组织进行器官分化与移栽

16. 实验 16 油菜的花药培养 培养室培养室培养室培养室

17. 2 、主要作法 （ 1 ）诱导愈作组织器官分化的培养基。 一般采用 MS 培养基补加 2mg/L6 苄基嘌呤和 3mg/L 激动素效果很好。试比较以下不同分化 培养基对花药愈伤组织分化的影响，将结果填 入表 16-2 。 （三） 诱导愈伤组织进行器官分化与移栽

18. 实验 16 油菜的花药培养 培养基培养基培养基培养基

19. 表 16-2 不同分化培养基对油菜花药愈伤组织分化的影响 分化培养基组成 （ mg/L ） 愈伤组织 块数 愈伤组织分 化苗数 分化百分率 （ % ） MS+ 激（ 2 ） + 吲 （ 0.2 ） 50 MS+ 激（ 4 ） + 吲 （ 0.2 ） 50 MS+ 激（ 3 ） 50 MS+ 激（ 10 ） 50 MS+ 苄（ 1 ） 50 MS+ 苄（ 2 ） 50

20. 实验 16 油菜的花药培养 （ 2 ）管理 当愈伤组织长到 2-3mm 大小时，转移到诱导器 官分化的培养基上，置于 23-28 ℃恒温室内，每天 光照 9-11 小时，光强 2000Lx 以上。 这样愈伤组织 1-3 周后可见绿，再过 2-3 周可见 到从绿点抽出一丛或一片小叶。而在愈伤组织其 它部分长出根的突起，随即叶片伸展。 有时根发生稍迟，在叶伸展时才出现根的突起 或更迟，这时应转移到 1/2MS 培养基上，可长成完 整幼苗。

21. 实验 16 油菜的花药培养 由花药长成的愈伤组织，中间出现绿点

22. 由愈伤组织长成的叶

23. 由愈伤组织长成的叶簇

24. 由愈伤组织长成的叶

25. 经花药长成的小苗

26. 经花药长成的小苗

27. （ 3 ）幼苗移栽 待分化好的幼苗 3-4 片叶时即可移栽。 移栽前先将根部的培养基冼净，然后栽入装 有无土培养物的小花钵中，开始需用烧杯罩住 幼苗，防止水分蒸发而死苗，待成活后取掉烧 杯子。 （三） 诱导愈伤组织进行器官分化与移栽

28. 实验 16 油菜的花药培养 移栽成活的小苗

29. 实验 16 油菜的花药培养 1 、在油菜花药培养中，以哪个花粉发育时期花药最好，为什 么？花蕾大小与花粉发育时期有无相关性？ 2 、哪种分化培养基的效果最好？在不同分化培养基上长出的 幼苗在形态上是否一致？为什么？ 3 、如何提高油菜幼苗移栽成活率？有哪些关键环节？ 四、 作业