1. Reproduction Techniques in Animals Presented by: A. Riasi Ph. D. in animal nutrition and Physiology http://riasi.iut.ac.ir تکنیک های تولید مثلی در دام

2. تکنیک انتقال رویان Embryo Transfer (ET)

3.  اهداف این جلسه تاریخچه و مراحل تکنیک انتقال رویان معیارهای انتخاب و آماده سازی حیوانات ماده دهنده ی رویان روش های ایجاد چند تخمک ریزی در حیوانات مختلف روش جمع آوری رویان نگهداری کوتاه مدت و ارزیابی رویان ها یخ زدن و یخ گشایی رویان ها انتخاب حیوانات گیرنده و همزمان کردن فحلی آنها روش انتقال رویان به رحم حیوان گیرنده

4. تکنیک انتقال رویان (Embryo transfer) انتقال زایگوت (Zygote transfer) انتقال تخمک (Ovum transfer)  نام های مختلف این تکنیک

5. دهه ی 1890 ، در خرگوش دهه ی 1930 ، در گوسفند و بز دهه ی 1970 ، در گاو شیری 1983 ، در انسان 2003 ، بررسی مشکلات موجود و پیشنهاد راه حل های مناسب  تاریخچه انتقال رویان

6. 1- انتخاب و آماده کردن حیوان ماده دهنده 2- ایجاد چند تخمک ریزی در حیوان ماده دهنده 3- تلقیح مصنوعی حیوان دهنده 4- جمع آوری رویان ها 5- نگهداری کوتاه مدت وارزیابی رویان ها 6- یخ زدن و یخ گشایی رویان ها 7- انتخاب حیوانات گیرنده و همزمان کردن فحلی آنها 8- انتقال رویان ها به رحم حیوانات گیرنده  مراحل تکنیک انتقال رویان

7. معیارهای استاندارد انتخاب : داشتن چرخه های فحلی منظم در شروع بلوغ جنسی نیاز نداشتن به بیشتر از دو نوبت تلقیح بازای هر آبستنی فاصله های گوساله زایی حدود 365 روز ( برای گاو ) نداشتن مشکلات سخت زایی یا ناهنجاری های تولید مثلی نداشتن نواقص ژنتیکی قابل تشخیص داشتن درجه تیپ مناسب  انتخاب و آماده کردن حیوان ماده دهنده

8. Superovulation PMSG FSH Equine pituitary extract eCG  ایجاد چند تخمک ریزی در گاو

9. تزریق هورمون FSH-P یا FSH خالص به مدت چهار روز تزریق هورمون PGF2α همزمان با تزریق FSH در روز سوم مشاهده علایم فحلی بفاصله 48 تا 60 ساعت پس از تزریق پروستاگلاندین درصورتی که حیوان دارای کیست های تخمدانی باشد باید با استفاده از کپسول های کاشتنی پروژسترون نسبت به برقراری فحلی مجدد اقدام کرد.  ایجاد چند تخمک ریزی در گاو

10. تاریخزماندوزدارو 15 اردبیهشت 15 اردیبهشت 16 اردیبهشت 17 اردیبهشت 18 اردیبهشت 7 صبح 7 شب 7 صبح 7 شب 7 صبح 7 شب 7 صبح 7 شب 3/1 میلی لیتر 0/1 میلی لیتر 0/4 میلی لیتر 8/0 میلی لیتر 6/0 میلی لیتر هورمون FSH هورمون لیز کننده هورمون FSH هورمون FSH ( و خارج کردن کپسول ) هورمون FSH  ایجاد چند تخمک ریزی در گاو

11. پروژستین درمانی CIDR اسفنج آغشته به پروژسترون  ایجاد چند تخمک ریزی در گوسفند و بز

12. مراحل کار : تزریق هورمون FSH یا eCG در روزهای 11 تا 13 چرخه فحلی درصورت همزمان سازی فحلی تزریق هورمون FSH بفاصله 72 ساعت قبل از خارج کردن اسفنج آغشته به پروژسترون و تکرار آن به مدت 3 تا 4 روز  ایجاد چند تخمک ریزی در گوسفند و بز

13. چند تخمک ریزی در مادیان چندان موفقیت آمیز نبوده است. مادیان به تزریق eCG پاسخ نمی دهد. تزریق عصاره هیپوفیز اسب یا تزریق GnRH نیز موجب تولید تعداد محدودی تخمک می شود.  ایجاد چند تخمک ریزی در مادیان

14. برای به دست آمدن بهترین نتیجه موارد زیر توصیه می شود : 1- انجام چند نوبت تلقیح در مدت فحلی و بعد از آن 2- استفاده از منی حاوی درصد زیاد اسپرم های طبیعی و فعال 3- انتخاب محل مناسب برای تخلیه منی در رحم 4- در صورت انجام جفت گیری طبیعی تکرار آن هر 8 ساعت یکبار  تلقیح مصنوعی حیوان سوپراوولاسیون شده

15. وسایل مورد نیاز در روش غیر جراحی : 1- یک لوله نرم و قابل انعطاف به نام سوند فولی 2- لوله های رابط و گیره ها 3- میله ی فلزی به نام استایلت 4- کیسه ها یا بطری های حاوی مایعات مورد نیاز 5- فیلترها  رویان گیری از گاو

17. مراحل رویان گیری : 1- مهار گاو دهنده بفاصله ی 7 روز پس از تلقیح مصنوعی 2- تزریق 10 میلی لیتر محلول بی حس کننده در بالای دم 3- شستشو و آبکشی اطراف فرج و مقعد گاو با محلول بتادین 4- وارد کردن سوند فولی نمره 20 به همراه میله استایلت 5- وارد کردن هوا به سوند تا بادکنک آن در دهانه سرویکس محکم شود 6- فرستادن محلول نمکی بافر فسفات ( دالبکو ) به همراه آنتی بیوتیک و سرم جنین گوساله یا آلبومین سرم گاو به داخل رحم  رویان گیری از گاو

18. 7- ماساژ دادن یک سوم بالایی رحم و تخلیه ی مایعات از راه سوند 8- تکرار مرحله ی 6 و 7 برای چند بار 9- انتقال رویان ها به آزمایشگاه  رویان گیری از گاو

25.  رویان گیری از گوسفند و بز مراحل کار به شرح زیر است : 1- قطع آب و خوراک بمدت 24 ساعت و آماده کردن حیوان برای بیهوشی 2- مهار کردن حیوان بر روی یک میز جراحی 3- ایجاد یک شکاف کوچک در ناحیه ی بین پستان ها و فرج 4- بررسی وضعیت تخمدان ها و بررسی پاسخ تخمدان ها 5- ایجاد یک شکاف 7 تا 10 سانتی متری در مسیر خط میانی شکم

26.  رویان گیری از گوسفند و بز

27. 6- وارد کردن سوند فولی نرم به شاخ رحم و محکم کردن سوند 7- وارد کردن یک سوند کوچک از بالای شاخ رحم 8- تخلیه ی 25 تا 50 میلی لیتر مدیوم فلاشینگ رویان با کمک سوند فولی 9- جمع آوری مایع فلاشینگ و حاوی رویان ها 10- تکرار مراحل 6 ، 7 و 8 برای شاخ بعدی رحم از محلول نمکی بافر فسفات حاوی 10 درصد سرم جنین گوساله یا محلول دالبکو با pH 2/7 و حاوی 10 درصد سرم گرما دیده بز بعنوان محلول فلاشینگ استفاده شده است.

28.  رویان گیری از گوسفند و بز 11- بعد از جمع آوری رویان ها باید محل جراحی دوخته شود 12- تزریق هورمون پروستاگلاندین داخل ماهیچه ای 13- انجام مراقبت های ویژه پس از جراحی تا بهبودی محل زخم 14- اجازه دادن به حیوان برای انجام یک آبستنی طبیعی پس از هر دو یا سه نوبت جمع آوری رویان

29.  نگهداری کوتاه مدت و ارزیابی رویان ها رویان ها تا 10 ساعت می توانند در دمای آزمایشگاه زنده بمانند. در دمای یخچال تا 4 روز می توان رویان ها را نگهداری کرد. ارزیابی رویان ها دارای استانداردهایی است و مراحل آن عبارتند از : 1- صاف کردن محلول حاوی رویان ها با کمک قیف مخصوص 2- تخلیه ی محتویات قیف در داخل یک پتری دیش مدرج

30.  نگهداری کوتاه مدت و ارزیابی رویان ها 3- شستشوی دیواره های جانبی و کف قیف با محلول بافر نمکی و تخلیه مواد به داخل پتری دیش مدرج

31.  نگهداری کوتاه مدت و ارزیابی رویان ها 4- بررسی رویان ها در زیر میکروسکوپ

32.  نگهداری کوتاه مدت و ارزیابی رویان ها 5- جدا کردن رویان های زنده و غیر زنده با کمک یک پیپت 6- انتقال رویان ها ی زنده به یک پتری دیش 4 حفره ای چاهک دار براساس کیفیت و درجه بندی آنها با کمک میکروسکوپ نوری (70 ×)

33.  نگهداری کوتاه مدت و ارزیابی رویان ها برخی از مهمترین معیارهای تعیین کیفیت و درجه بندی رویان ها عبارتند از : 1- فشردگی سلولی 2- شکل 3- یکنواختی اندازه بلاستومرها 4- رنگ و بافت سیتوپلاسم سلولی 5- وجود وزیکول های سلولی 6- اندازه رویان ها 7- وضعیت زوناپلوسیدا 8- قطعه های سلولی 9- هماهنگی رشد و سن رویان

34.  یخ زدن و یخ گشایی رویان ها نگهداری طولانی مدت رویان ها در داخل نیتروژن مایع انجام می شود. عوامل موثر بر میزان موفقیت در یخ زدن رویان : 1- گونه حیوان 2- مرحله رشد رویان ها 3- فاصله ی زمانی از رویان گیری تا یخ زدن 4- کنترل کیفیت مراحل رویان گیری 5- نوع محافظت کننده ی مورد استفاده 6- تجربه ی رویان شناس

35.  یخ زدن و یخ گشایی رویان ها از مواد مختلف برای محافظت رویان ها در برابر یخ زدن استفاده می شود : الف ) اتیلن گلیکول ب ) دی متیل سولفوکساید ج ) گلیسرول

36.  یخ زدن و یخ گشایی رویان ها امورز از روش vitrification برای یخ زدن رویان ها استفاده می شود. در این روش نیازی به اجرای برقرار دوره تعادل رویان ها با ماده محافظ یخ زدگی وجود ندارد. محلول مورد استفاده در این روش شامل ترکیبات زیر است : 1- اتیلن گلیکول 2- فایکول 3- سوکروز

37.  یخ زدن و یخ گشایی رویان ها مراحل قدم به قدم یکی از روش های موفقیت آمیز یخ زدن و یخ گشایی رویان بشرح زیر است : 1- تهیه ی رویان های درجه یک 2- انتقال رویان ها به یک محلول نمکی بافر فسفات حاوی 10% سرم از قبل گرم شده 3- انتقال رویان ها به ظرف حاوی محلول نمکی فسفات + 10% سرم + 10% گلیسرول برای مدت 20-10 دقیقه 4- قرار دادن رویان ها در استرا با ظرفیت 0/25 یا 0/5 میلی لیتر 5- ثبت مشخصات رویان بر روی استرا

38.  یخ زدن و یخ گشایی رویان ها 6- گذاشتن استرا در داخل فریزر و سرد کردن آن با نرخ معین، برای این منظور ابتدا با نرخ کاهشی 2 تا 4 درجه در دقیقه دمای استرا به 6- یا 7- درجه رسانده می شود و برای مدت 15 دقیقه همین دما حفظ می شود 7- سرد کردن استرا با نرخ 0/5 درجه در دقیقه تا دمای 30- و برای مدت 2 تا 3 دقیقه همین دما حفظ می شود 8- انتقال استرا به نیتروژن مایع در مدت 2 تا 3 ثانیه

39.  یخ زدن و یخ گشایی رویان ها مراحل یخ گشایی عبارتند از : 1- قرار دادن استرا به مدت 12 یا 20 ثانیه در هوای آزاد 2- گذاشتن استرا بمدت 20-15 ثانیه در حمام آب 37 درجه 3- خارج کردن گلیسرول از رویان ها خارج کردن گلیسرول از رویان ها با روش رقیق سازی چند مرحله ای و البته در صورت استفاده از اتیلن گلیکول بعنوان ماده محافظ سرما، نیازی به اینکار نیست.

40.  یخ زدن و یخ گشایی رویان ها مراحل رقیق سازی 6 مرحله ای برای خارج کردن گلسیرول : 1- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات + 10% سرم + 8/3 % گلیسرول 2- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات + 10% سرم + 6/7 % گلیسرول 3- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات + 10% سرم + 5 % گلیسرول 4- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات + 10% سرم + 3/3 % گلیسرول 5- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات + 10% سرم + 1/7 % گلیسرول 6- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات + 10% سرم + 0 % گلیسرول

41.  یخ زدن و یخ گشایی رویان ها مراحل رقیق سازی 4 مرحله ای برای خارج کردن گلسیرول : 1- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات +10% سرم + 6% گلیسرول + 10/3 درصد سوکروز 2- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات +10% سرم + 3% گلیسرول + 10/3 درصد سوکروز 3- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات + 10/3 درصد سوکروز 4- انتقال رویان به محلول نمکی بافر فسفات

42.  انتخاب حیوانات گیرنده و همزمان کردن فحلی آنها مهمترین معیارهای انتخاب ماده های گیرنده : 1- جوان و سالم 2- دارای جثه بدنی مناسب 3- تامین نیازهای غذایی حیوانات ماده گیرنده باید بفاصله 6 تا 7 روز قبل از انتقال رویان فحل شده باشند و قبل از انتقال رویان باید بررسی شود که کدام تخمدان تخمک ریزی کرده و جسم زرد فعال دارد.

43.  انتقال رویان به رحم حیوان گیرنده مراحل انتقال رویان به رحم حیوان گیرنده عبارتند از : 1- مهار حیوان گیرنده در جایگاه مناسب 2- تزریق لیدوکائین در بالای دم 3- وارد کردن دست به رکتوم و سپس شستشوی ناحیه رکتوم و واژن 4- ضد عفونی کردن دهانه رکتوم و واژن و سپس آبکشی آن 5- شناسایی تخمدان تخمک ریزی کرده 6- پر کردن استرا با رویان مطابق آنچه قبلا گفته شد 7- گذاشتن استرا در سرنگ و روکش پلاستیکی سرنگ 8- وارد کردن سرنگ به رحم و سپس شاخ رحم 9- تخلیه رویان در شاخ رحم

44.  انتقال رویان به رحم حیوان گیرنده