1. MicroARNs, comparaison, prediction
Eric Bonnet
Bioinformatics & Evolutionary Genomics
Department of Plant Systems Biology
Ghent University / VIB
Belgium

2. Small RNAs biogenesis and function

3. Plan de la presentation
But de la presentation
Biogenese, fonction et prediction des petits ARN non-codants.
Plan de la presentation
1/ Biogenese et fonction des petits ARN non-codants
2/ Principes de prediction bioinformatique des microARN

4. Tiling arrays
Tiling arrays: using probes to analyze expression of complete genomic regions.
=> transcriptome (a lot) bigger than expected.
=> many non coding RNAs
Les tiling arrays sont des puces a ADN permettant d'examiner la transcription a l'echelle d'un chromosome entier, voir d'un genome.
Un des resultats surprenants obtenus avec cette technique est que la transcription est beaucoup plus importante que prevu, y compris dans les espaces intergeniques.
Cela pose de nombreuses questions quand au role de ces nombreux ARN dits non-codants, c'est a dire ne produisant pas de proteines.

5. Non coding RNAs classes
Degradation products
Ribosomal RNA
Transfer RNA
Small nucleolar RNA …
microRNA (miRNA)
Short interfering RNA (siRNAs)
Les ARN non codants sont connus depuis longtemps, comme par exemple les ARN ribosomaux (rRNA) ou encore les ARN de transfert (tRNA).
Cependants certaines classes d'ARN non codants sont apparues recemment, comme les petits ARNs regulateurs.
Ces petits ARNs sont scindes en deux classes, les petits ARN d'Interference (short interfering RNA ou siRNA) et les microARN (microRNA ou miRNA).

6. Small RNAs Very short: ~21 nt Discovered (very) recently (1993)
Regulate expression of protein coding genes at the post-transcriptional level
“Dark matter” of Biology
Les petits ARN sont vraiment tres petits : une vingtaine de nucleotides seulement.
Ils ont ete decouverts tres recemment: 1993 pour la decouverte du premier microARN par Victor Ambros et son equipe, chez C. elegans.
Ils ont en commun une propriete fondamentale qui est de reguler l'expression des genes proteiques, via des modifications post-transcriptionelles de l'ARN messager.
Certains biologistes (enthousiastes) ont compare cet univers des petits ARN a la fameuse matiere noire de l'univers (sans doute apres quelques verres de biere...).

7. Small RNA biogenesis
Ce schema represente le mecanisme de base de biogenese des petits ARN.
Une molecule d'ARN double-brin est reconnue et decoupee en petites unites d'une vingtaine de nucleotides de long par une ribonuclease de la famille des DICER.
Un des brins est ensuite incorpore dans un complexe ribonucleique nomme RISC (Ribonucleic Induced Silencing Complex).
Le petit ARN guide l'appariement du complexe sur un ARN messager cible, ce qui va declencher l'action de repression (clivage ou repression de la traduction)
Les proteines actives du RISC sont des membres de la famille des Argonautes (AGO).

8. miRNA versus siRNA miRNA: siRNA
Processed from imperfect stem-loop hairpin-like structures.
Encoded by independent loci.
siRNA
Processed from long double stranded RNA sequences.
Regulate the genes from which they originate.

9. miRNA biogenesis
Voici un exemple un peu plus realiste de biogenese des microARN chez les plantes.
On peut voir que de nombreuses etapes supplementaires existent, mais on retrouve l’enzyme DICER (DCL1) et le complexe RISC avec la proteine Argonaute (AGO1).
Chez les plantes, le mode majeur de regulation des ARN messagers est la degradation par clivage.
On peut noter que le microARN va reguler un gene cible different de celui qui l’encode.

10. siRNA biogenesis
Biogenese des siARN. L’exemple concerne un ARN de virus qui est converti en ARN double brin durant sa biogenese. L’enzyme DCL4 reconnait la molecule et la scinde en petites sous-unites. Un des brins est alors incorpore dans le RISC et va reprimer en retour l’ARN viral.
Ici les siRNA regulent l’ARN messager dont ils sont issus.
On peut aussi observer une etape amplification par production d’ARN double brin supplementaire par une RNA-dependante RNA polymerase (RDR). C’est une etape typique des siRNA, que l’on ne retrouve pas avec les miRNA.

11. Quelques examples de structures secondaires en tige-boucle (ou epingle a cheveux) caracteristique des miRNA. A gauche deux miRNA de C. elegans, a droite des miRNA de plantes.
Noter la longueur variable des structures tige-boucle chez les plantes.

12. miRNA / siRNA functions
Regulation of gene expression [miRNA]
Defense against exogenous sequences (viruses, pathogens, etc..). [siRNA]
Chromatin structure: siRNA mediates silencing of Tranposons, transgenes at the DNA level (methylation). [siRNA]

13. miRNA function in animals
Un exemple de fonction des miRNA chez les animaux: regulation de la transition ARN maternel ARN embryon chez le poisson, avec un role crucial pour le miRNA miR-430.

14. ???
Un phenotype du a une regulation par microARN: la race Texel chez les moutons.
Ce phenotype est du a la repression de l’expression de la myostatine, proteine qui controle le developpement musculaire.
Des mutations ponctuelles ont provoque l’apparition dún site cible pour un microARN dans la partie 3’ UTR de la myostatine. Ce gene etant reprime, le developpement musculaire est plus important.

15. miRNA function in plants
Exemples de fonction des miRNA chez les plantes.
Les microARN sont au centre (chiffres) puis viennent leurs cibles et enfin les fonctions des genes cibles.
Plus de 70% des genes cibles des microRAN chez Arabidopsis sont des facteurs de transcription et beaucoup sont impliques dans des fonctions liees au developpement.

16. miRNA gene prediction

17. miRNA computational prediction= ?
La prediction des microARN ressemble a la recherche d’une aiguille dans une botte de foin: sur un chromosome d’Arabidopsis on peut trouver des centaines de millier de sequences ayant une structure tige-boucle comparable a celle des veritables miRNA.
Comment faire pour eviter les faux positifs ?

18. Solution: filtering Reduce false positives using:
Structural & compositional features
Comparative genomics
Statistical properties

19. Structural & compositional features
MiRNA is part of one continuous helix
Unpaired bases miRNA: max 5 & Maximum bulge size: 2
G.U pairs: maximum 5
Unpaired bases miRNA*: max 5
Paired bases : minimum 15
Free energy: maximum -30 Kcal/mol
Utilisation de parametres caracterisant les structures tige-boucle: nombre de bases appariees, bases non appariees, contenu en GC, energie libre.
MiRNA GC content & entropy value

20. Comparative genomics
Utilisation de la conservation des sequences de microARN dans deux organismes voisins.
Ici on compare Arabidopsis avec le riz et on extrait toutes les sequences conservees ayant la taille d’un microARN (21nt).
Puis on essaye de voir si chaque hit peut former une structure tige-boucle acceptable dans chaque organisme.
Si on une structure acceptable de chaque cote, on a peut etre un bon candidat.

21. Precursor statistical properties
Permutation test:
Compare Free energy value for a miRNA precursor with the value of re-shuffled sequences.
On peut aussi essayer de discerner les vrai miRNA a l’aide de proprietes statistiques.
Ici la valeur de l’energie libre pour une structure donnee de miARN est statistiquement differente de celle obtenue pour la meme sequence mais melangee.
Ce n’est pas le cas pour d’autres types d’ARN non codants (voir exemple de droite pour un tARN)

22. miRNA gene prediction in plants
Un exemple d’integration de differentes techniques pour predire les microARN conserves entre Arabidopsis et le riz (Oryza sativa).

23. miRNA genes prediction in animals
Un autre exemple d’integration chez les animaux.

24. What’s the catch ?
=> Evidence for miRNA genes not conserved in other organisms (specific).
=> Comparative genomics filter can not be used
=> Use RNA high-throughput expression data (MPSS, “454”) to check predictions.
Certains travaux montrent que de nombreux microARN ne sont pas conserves et sont plus ou moins specifiques a un organisme.
Dans ce cas il est impossible d’appliquer le filtre evolutif pour predire les microARN.
Une des solutions possibles est d’utiliser le resultats de sequencage massifs de petits ARNs et de l’incorporer en tant que source d’evidence supplementaire dans le pipeline de prediction.

25. miRNA targets prediction
Un domaine aussi tres actif de recherche est la prediction des genes cibles des microARN.
Cela est tres difficile chez les animaux en raison de l’appariement tres imparfait entre le microARN et son ARN messager cible, avec de nombreuses bases non appariees.

26. Future
Un des buts ultimes de l’etude des microARN est l’integration de leur role dans des reseaux de regulation, comme ici pour la regulation de la chronologie de la floraison chew Arabidopsis.

27. Bibliography
Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell Jan 23;116(2):
Baulcombe D. RNA silencing in plants.Nature Sep 16;431(7006):
Bonnet E, Van de Peer Y, Rouze P. The small RNA world of plants.New Phytol. 2006;171(3):