1. שיטות אבחון בעזרת נוגדנים = אימונודיאגנוסטיקה
נושא 3
שקופיות
שיטות אבחון בעזרת נוגדנים = אימונודיאגנוסטיקה 1 4 3 2
שקיעת תלכידים
של תצמידי
נוגדן-אנטיגן
אימונו בלוטינג
הספג מערבי
Western
Blotting
לחקר חלבונים
סימון נוגדנים
או אנטיגנים
תגובת הצמתה
אגלוטינציה
המאגלוטינציה
רדיואקטיבי
RIA
אימונופרסיפיטציה
השקעת תצמידים
אימונו דיפוזיה
רדיאלית בג'ל
(מבחן הטבעת)
המאגלוטינציה
חיובית / שלילית
אנזימי
ELISA
פלואורסצנטי
FIA
*שיטות סרולוגיות= קביעות הנעשות ע"י שימוש בנסיוב
(סרום) לקביעה אימונולוגית איכותית וכמותית.
נסיוב זהו נוזל הדם לאחר הרחקת הקריש.
בנסיוב מצויים הנוגדנים בצורה מסיסה.
מבחן סימון
לא תחרותי
מבחן סימון
תחרותי 36

2. 1. שיטות קביעה המבוססות על שקיעת תלכידים לא מסיסים של תצמידי נוגדן-אנטיגן
תצמידים של נוגדן-אנטיגן , בתחום המנות השקולות , יוצרים , באופן ספונטני , תלכידים לא מסיסים. תלכידי התצמיד שוקעים על הג'ל ונוצר פס שקיעה לבן במקום. משני עברי הפס, יש תצמידים אך הם בלתי נראים מהיותם מסיסים.
כמות המשקע
עודף נוגדן
(מעט אנטיגן)
עודף אנטיגן
(מעט נוגדן)
תחום המנות השקולות
אזור הופעת המשקע הלבן
כמות האנטיגן
רק ביחס כמותי מסוים בין כמות הנוגדנים
לבין כמות האנטיגן יתקבלו התלכידים
ויווצר משקע תלכידים נראה לעין
בעודף נוגדנים אין יצירת תלכידים. (עודף הנוגדן יופיע בנוזל העליון)
בעודף אנטיגן אין תלכידים.
(עודף האנטיגן יופיע בנוזל העליון) 37

3. שיטה לדוגמה: אימונודיפוסיה רדיאלית באגר ( מבחן הטבעת )
תופעת השקיעה הספונטנית וקבלת פס שקיעה לבן באזור יחסי הריכוזים השקולים
משמשת בסיס לשיטה כמותית לקביעת ריכוז נוגדן או ריכוז אנטיגן בתמיסה.
השיטה מבוססת על אימונודיפוזיה רדיאלית בג'ל ונקראת "מבחן הטבעת" .
השיטה גם איכותית (קביעת ספציפיות אנטיגנית) וגם כמותית לצורך כיול ריכוזים.
השיטה משמשת בתחום הקליני-רפואי לקביעת רמות של אימונוגלובולינים בנסיוב הדם ובשתן חולים וגם לקביעת מרכיבי נסיוב אחרים כמו חלבוני המשלים.
פס הטבעת נוצר ע"י שקיעה ספונטנית של תצמידי נוגדן-אנטיגן הנמצאים ביחס ריכוזים שקולים , היוצר תלכידי תצמידים לא מסיסים. הפס הלבן של המשקע סביב לבור יוצר טבעת . המרחק בו נוצרת הטבעת תלוי בריכוז האנטיגן או הנוגדן שבבור וגם תלוי בגודל המולקולות הנעות בדיפוזיה. 38

4. עיקרון השימוש בשיטה של מבחן הטבעת
1. מערבבים את הנוגדן באגר נוזלי (לא חם מדי ) ומקרישים בצלחת או על זכוכית נושאת .
ריכוז הנוגדן זהה בכל שטח האגר.
2. בבארות הכיול שמים ריכוזים ידועים של האנטיגן (תמיסות סטנדרט לקבלת עקום הכיול )
3. בבארות אחרות שמים דגימות נעלם שונות המיועדות לבדיקה.
4. מתרחש תהליך דיפוסיה של מולקולות האנטיגן בג'ל. מולקולות האנטיגן שבבאר נעות בדיפוזיה מהבאר החוצה בצורה רדיאלית (מעגלית) לכל הכיוונים , בתוך שכבת האגר.
5. לאורך הדרך נוצרים תצמידים עם הנוגדן המצוי בכל שכבת האגר. התצמידים נוצרים מסביב.
6. רק באזור ,שבו יש יחס כמותי שקול בין ריכוז האנטיגן לריכוז הנוגדן ,נוצרים תלכידים בלתי מסיסים של תצמידים ,השוקעים בצורת פס לבן על גבי שכבת האגר .
ככל שריכוז האנטיגן בבאר גבוה יותר , יתקבל פס השקיעה רחוק יותר מהבאר, כי רק אז יגיע לאזור שבו יש יחס מנתי שקול בינו לבין ריכוז הנוגדן המצוי באגר.
אפשר להפך: בגל יהיה ריכוז זהה של אנטיגן ובבורות שמים ריכוזים שונים של הנוגדן המיועד לכיול.
קוטר ( ריבוע הקוטר) הטבעת נמצא ביחס ישר (ליניארי ) לריכוז האנטיגן בבאר.
ריבוע קוטר
הטבעת
ריכוז האנטיגן 39

5. שיטה 2: אימונופרסיפיטציה : שיטה להשקעת תצמידי נוגדן – אנטיגן ע"י ספיחת זיקה ישירה
במטרה להפריד אנטיגן ספציפי מתערובת אנטיגנים אחרים משתמשים באימונופרסיפיטציה.
השיטה מבוססת על הוספת נוגדן ספציפי לאנטיגן המטרה כשהוא מקובע לחלקיקי ספרוז ויצירת תצמידים בתמיסה . חלקיקי הספרוז "לוכדים" את האנטיגן ושולפים אותו מהתערובת. בשלב השני, משקיעים את חלקיקי הספרוז עם התצמידים ע"י סרכוז בצנטריפוגה. במשקע נקבל את אנטיגן המטרה על חלקיקי הספרוז .
השיטה טובה לבידוד אנטיגן שהוא מרכיב תוך- תאי במטרה לחקור את נוכחותו או את כמותו בתא .
** כדי להקל על איתור התצמיד נוגדן-אנטיגן מקפידים לסמן את האנטיגן באיזוטופ רדיואקטיבי . הסימון מאפשר גם קביעה כמותית של האנטיגן .
מוסיפים חלקיקי ספרוז
הנושאים נוגדן ספציפי לאנטיגן המטרה (האדום)
אתר אנימציה של השיטה המתאר בידוד וזיהוי חלבון תוך-תאי : Y
אנטיגנים אחרים
בנוזל העליון Y
סרכוז Y
שחרור של
האנטיגן האדום
מהנוגדן ובדיקתו
בשיטות אנליטיות Y
האנטיגן האדום
במשקע Y 40
החלקיקים דגים את האנטיגן האדום
באמצעות הנוגדן הספציפי המקובע

6. אימונופרסיפיטציה משופרת: השקעת התצמידים ע"י ספיחתם לנוגדן שניוני מקובע לספרוז
במטרה להגדיל את רגישות השיטה ואת יעילותה משתמשים בשיטת השקעה לא ישירה ע"י שימוש בנוגדן שניוני כנגד Fc של הנוגדן הראשוני ( או בחלבון A , חלבון הנמצא על דופן תאי חיידקים והידוע בזיקתו ל Fc של נוגדן ) , כשהוא מקובע לחלקיקי הספרוז .
השיטה מבוססת על הוספת נוגדן ספציפי לאנטיגן בתמיסה ויצירת תצמידים ספציפיים בתמיסה. רק בשלב השני, "דגים" או "לוכדים" את התצמידים ע"י ספיחתם לחלקיקי שרף (ספרוז) שמקובע על פניהם נוגדן שניוני כנגד Fc של הנוגדן הראשוני. בשלב השלישי, משקיעים את חלקיקי הספרוז עם התצמידים ע"י סרכוז בצנטריפוגה. משחררים את חלבון המטרה מהחלקיקים בעזרת SDS ובודקים אותו בהרצה ב PAGE-SDS או באימונובלוטינג.
** כדי להקל על איתור התצמיד נוגדן-אנטיגן מקפידים לסמן את האנטיגן באיזוטופ רדיואקטיבי . הסימון מאפשר גם קביעה כמותית של האנטיגן.
נוגדן אנטי FC
מקובע לספרוז
חלקיקי
ספרוז Y Y Y Y Y Y Y Y
תצמידים חופשיים מבוקשים
אנטיגן המטרה בתצמיד
עם הנוגדן הספציפי לו
לכידת התצמידים מתוך התמיסה
ע"י ספיחתם לספרוז
באמצעות נוגדן כנגד הנוגדן הספציפי 41

7. שחרור האנטיגן מהתצמיד ע"י SDS
פירוט השלבים בשיטת האימונופרסיפיטציה המשופרת ע"י ספיחה לנוגדן שניוני (לא ישירה)
תערובת חלבונים המכילה אנטיגן המיועד לבידוד
מוסיפים נוגדן ספציפי
נוצרים תצמידים של נוגדן - אנטיגן בתמיסה
מוסיפים חלקיקי ספרוז- נוגדן שניוני
התצמידים נלכדים ע"י נוגדן שניוני המקובע לחלקיקי הספרוז
סרכוז בצנטריפוגה
מסרכזים להשקעת החלקיקים שספחו את התצמידים ושוטפים את המשקע להרחקת שאר מרכיבי התערובת שאינם תצמידים
משחררים את האנטיגן מהתצמיד ע"י SDS ובודקים ניקיון באימונובלוטינג עם נוגדן ספציפי
הוספת נוגדן שניוני
מקובע לחלקיק ספרוז
הוספת נוגדן
לחלבון המטרה
שחרור האנטיגן מהתצמיד ע"י SDS Y Y Y Y Y
הרצה בג'ל עם SDS ובדיקה
באימונובלוטינג
סרכוז
ושטיפות Y Y Y Y
אנטיגן המטרה
אנטיגן משוחרר
קבלת תצמידים
מסיסים בתמיסה 42
לכידת התצמידים

8. אימונופרסיפיטציה בשיטת השקעת תצמידי נוגדן – אנטיגן ע"י ספיחתם לחלבון A מקובע לספרוז
השיטה מבוססת על הוספת נוגדן ספציפי לאנטיגן הנמצא בתערובת ויצירת תצמידים ספציפיים בתמיסה. בשלב השני, "דגים" או "לוכדים" את התצמידים ע"י ספיחתם לחלקיקי שרף (ספרוז) שמקובע על פניהם חלבון A (חלבון הנמצא בדופן תאי חיידקים ). לחלבון A יש זיקה ל Fc של הנוגדן. בשלב הבא, משקיעים את חלקיקי הספרוז עם התצמידים ע"י סרכוז בצנטריפוגה.
** כדי להקל על איתור התצמיד נוגדן-אנטיגן מקפידים לסמן את האנטיגן באיזוטופ רדיואקטיבי .
תחומי יישום של השיטה:
מוסיפים חלקיקי ספרוז
הנושאים על שטחם חלבון A
נוזל עליון
שלא מכיל
את האנטיגן A
בידוד אנטיגן A*
ע"י הנוגדן
באימונופרסיפיטציה
משקע ספרוז
שאליו מחובר
התצמיד
נוגדן-אנטיגן A 43 1 2 3

9. שימושים של שיטת האימונופרסיפיטציה :
בידוד חלבונים (אנטיגנים) ע"י השקעתם בעזרת נוגדנים לקביעת תכונות כמו גודל מולקולארי או נקודה איזואלקטרית באלקטרופורזה דו-ממדית.
בידוד חלבונים מרקמה או מתאים כאשר יש חשד לקיומם .
זיהוי איכותי וקביעה כמותית של סינתזת חלבון בתאים .
דיון בשיטה :
חשוב שלא תהיה תגובה מוצלבת בין הנוגדן לאנטיגנים אחרים בתמיסה.
יש רקע בלתי ספציפי הנובע משקיעת חלבונים ללא קשר לתצמיד.
יש סכנת פירוק חלבונים ע"י פרוטיאזות (במקרים של בידוד מתוך תא)
וכדאי להוסיף מעכבים של פרוטיאזות בזמן הבידוד.
רגישות השיטה תלויה בכמות היחסית של חלבון המטרה ביחס לכלל החלבונים. 44

10. 2. שיטות קביעה המבוססות על תגובות הצמתה = אגלוטינציה1
המאגלוטינציה ישירה / לא ישירה
אגלוטינציה ישירה / לא ישירה
נוגדנים יכולים לעשות אגלוטינציה של אנטיגן רב-ערכי (מולטי וולנטי ) כדוגמת תאים, תאי דם ותאי חיידקים.
הנוגדנים המצמתים נקראים נוגדנים אגלוטינינים . הנוגדנים נקשרים לדטרמננטות ספציפיות
( אתרי קישור ) על שטח הפנים של התאים ויכולים לגרום להצמתה של התאים.
הצמתה ישירה של תאים ( כמו תאי חיידקים ) = אגלוטינציה .
הצמתה ישירה של תאי דם אדומים = המאגלוטינציה .
אגלוטינציה והמאגלוטינציה מבוססות על תגובה ישירה בין הנוגדנים לבין דטרמננטות של התאים עצמם ולכן נקראות אגלוטינציה ישירה ( direct ) .
אפשר להשתמש בתאים (כדוריות דם אדומות או כדורים עשויים זכוכית או פלסטיק ) ששטח פניהם עבר ציפוי (קיבוע) במולקולות אנטיגניות שונות כדי לאתר נוגדנים למולקולות האנטיגניות הללו. וכאן , התגובה מבוססת על תגובה עקיפה ולא ישירה בין הנוגדנים לבין הדטרמננטות המקובעות על גבי הכדורית. הכדורית משמשת "נשא" של הדטרמננטות בלבד. לכן תגובה מסוג זה נקראת אגלוטינציה או המאגלוטינציה "פסיבית", ז.א. המאגלוטינציה לא ישירה ( indirect ). 45

11. Y Y Y Y Y עיקרון אגלוטינציה ישירה
הצמתה של אנטיגן (רב-ערכי) ע"י הנוגדן ( שהוא דו-ערכי ) :
כאשר דטרמיננטה מסוימת מופיעה מספר פעמים על האנטיגן תתקבל תופעה של הצמתה בנוכחות הנוגדן לאותה דטרמיננטה : תתקבל אגלוטינציה של מולקולות האנטיגן בנוכחות הנוגדן לאותה דטרמיננטה .
הנוגדן משמש "גשר" מלכד היוצר תלכידים של התצמידים
אנטיגן רב – ערכי Y Y Y Y Y
אגלוטינציה (הצמתה) של אנטיגן ע"י נוגדנים מצמתים ספציפיים לאנטיגן 46

12. דוגמאות למבחן אגלוטינציה של אנטיגנים ע"י נוגדנים
מבחן אגלוטינציה לזיהוי תאי חיידק
ע"י נוגדן פנטהמרי מסוג IgM כנגד החיידק
מבחן אגלוטינציה לזיהוי חלקיקי וירוס
ע"י נוגדן דו-זרועי מסוג IgG כנגד הוירוס 47
גוש ( clump ) של תאים שנוצר בנוכחות נוגדן

13. קביעה כמותית של אנטיגן בשיטת אגלוטינציה
השיטה:
מכינים סידרת מהולים של דגימת האנטיגן.
מוסיפים כמות קבועה וזהה של נוגדנים.
מדגירים למשך זמן מוגדר.
בודקים באילו מבחנות הופיעה אגלוטינציה.
המיהול האחרון שעדיין נותן אגלוטינציה משמש בקביעה הכמותית .
תגובה שלילית
"כפתור"
תגובה חיובית
"פרח"
תגובה שלילית
אגלוטינציה (- )
תגובה חיובית
אגלוטינציה ( + )
תלכידים היוצרים "פרח" 48

14. קביעה כמותית של נוגדן לאנטיגן בשיטת אגלוטינציה
שיטת האגלוטינציה משמשת גם שיטה כמותית לכיול נוגדנים
השיטה :
מכינים סידרת מהולים כפולים של הנוגדן.
מוסיפים כמות קבועה וזהה של האנטיגן .
מדגירים למשך זמן מוגדר.
בודקים באילו מבחנות הופיעה אגלוטינציה.
קובעים את המיהול האחרון של הנוגדן שעדיין נותן אגלוטינציה.
אגלוטינציה חיובית
בצורת "פרח"
חוסר אגלוטינציה
בצורת "כפתור" 49

15. מיהול הנסיוב (נוגדנים) טווח המהולים של ההמאגלוטינציה
בדיקה כמותית של נוגדנים בשיטת האגלוטינציה
מיהול הנסיוב (נוגדנים)
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
1:512
טווח המהולים החיוביים
1:8 – 1:128
המהול האחרון 1:128
שעדיין נותן הצמתה
קובע את כמות היחידות בדגימה
חוסר
אגלוטינציה
חוסר
אגלוטינציה
טווח המהולים של ההמאגלוטינציה
כמות
המשקע
מיהול הנסיוב 50

16. קביעה וזיהוי סוג דם - דוגמה להמאגלוטינציה ישירה
קביעה וזיהוי סוג דם - דוגמה להמאגלוטינציה ישירה
קביעת סוג דם היא בעצם קביעה של האנטיגנים המצויים על תאי הדם האדומים בעזרת נוגדנים במבחן ההמאגלוטינציה ישירה
סוג הדם
הנוגדן
הוספת
אנטי A A - +
הנוגדנים הטבעיים : אנטי A ואנטי B
הם נוגדנים מסוג אגלוטינינים
והם מסוגלים לצמת כדוריות דם אדומות
שנושאות על שטחן דטרמננטות אנטיגניות
טבעיות ספציפיות לנוגדנים B
הוספת
אנטי B - +
הוספת
אנטי A
+ אנטי B AB + +
הוספת
אנטי A
+ אנטי B O - - 51

17. מבחן אגלוטינציה פסיבית – המאגלוטינציה לא ישירה
1. מצפים כדוריות דם אדומות או כדוריות פלסטיק באנטיגן ע"י קיבוע כימי. הכדורית הופכת נשא של האנטיגן.
2. מוסיפים נוגדנים כנגד האנטיגן המצפה.
3. הנוגדנים יגרמו להצמתה של הכדוריות האדומות. Y
מולקולות של
אנטיגן רצוי
הוספת נוגדן לאנטיגן
שעל הכדורית Y Y Y Y
אגלוטינציה לא ישירה Y
כ. ד. א.
טבעית
כ.ד.א.
מצופה
באנטיגן
שימושים ויתרונות :
השיטה טובה לזיהוי קשר ספציפי בין נוגדן לאנטיגן .
השיטה גם כמותית לקביעה של כייל נוגדנים כנגד אנטיגן.
השיטה נוחה (מאקרוסקופית) 52

18. מבחן ביטול הצמתה ( עיכוב המאגלוטינציה ) ע"י אנטיגן חופשי
מבחן ביטול הצמתה ( עיכוב המאגלוטינציה ) ע"י אנטיגן חופשי
( מבחן ביטול המאגלוטינציה זה משמש בבדיקת הריון )
1. מצפים כדוריות אדומות או חלקיקים סינתטיים באנטיגן X (אנטיגן שמבקשים לבדוק את נוכחותו בדם או בשתן הנבדק) .
2. מערבבים נוגדנים הספציפיים לאנטיגן X + דגימת דם או שתן של החולה החשודה לנוכחות אנטיגן X עם הכדוריות המצופות באנטיגן X.
3. במערכת הנבדקת תהיה תחרות בין האנטיגן X שבדגימה לבין האנטיגן X המקובע לכדוריות על הקשירה לנוגדן .
4. אם לא נקבל המאגלוטינציה : משמע שבדגימת הנבדקת היה אנטיגן X שנקשר לנוגדנים וגרם לירידה בהמאגלוטינציה .
5. אם תתקבל המאגלוטינציה : משמע שבדגימה הנבדקת אין אנטיגן X. הנוגדנים נקשרו לאנטיגן X המקובע לכדוריות ועקב כך, גרמו להצמתה שלהן.
בדיקה חיובית "כפתור"
בדגימת החולה יש אנטיגן המונע את האגלוטינציה
בדיקה שלילית
"פרח"
בדגימה אין כבר אנטיגן והאגלוטינציה מתקיימת
המאגלוטינציה (-) כפתור
התוצאה של החולה
חיובית
המאגלוטינציה (+) פרח
התוצאה של הנבדק שלילית 53

19. Y Y Y Y בדיקת הריון - דוגמה למבחן עיכוב המאגלוטינציה ע"י אנטיגן חופשי
בדיקת הריון - דוגמה למבחן עיכוב המאגלוטינציה ע"י אנטיגן חופשי
האנטיגן הנבדק = הורמון ההיריון hCG . ההורמון מופרש ע"י השליה המתפתחת במהלך ההיריון .
מקבעים מולקולות של הורמון hCG לכדוריות ומערבבים עם הנוגדן ועם דגימת שתן הנבדקת.
אי הופעת אגלוטינציה פירושה בדיקה חיובית .
אין הצמתה של כדוריות הדם כי האנטיגן החופשי התחרה על הנוגדן וחסם את אתרי הקישור של הנוגדן
אנטיגן חופשי
מקורו בדגימה של
החולה הנבדק Y Y Y Y
כדור סינתטי
נושא אנטיגן מקובע
מולקולה של נוגדן
נגד האנטיגן המקובע
אין הצמתה (המאגלוטינציה שלילית )
תשובה חיובית לנוכחות האנטיגן בדגימת החולה 54

20. 3. שיטות קביעה המבוססות על סימון תצמידים של אנטיגן או נוגדן
סימון אנזימי
על משטח מוצק
סימון פלואורסצנטי
סימון רדיואקטיבי
FIA
ELISA
RIA
חשוב:
מסמנים נוגדן או אנטיגן מבלי לפגוע בפעילות הביולוגית שלו .
צריך להפריד בין התצמיד המסומן לבין עודף הנוגדן החופשי שגם הוא מסומן .
השיטה צריכה להצטיין בספציפיות גבוהה וברגישות גדולה .
בפאזת מוצק :
ההפרדה בין התצמיד המסומן לבין המגיב החופשי המסומן ע"י -
קיבוע הנוגדן או האנטיגן לנשא פולימרי בלתי מסיס ( שטח פני מבחנה, צלחת או באר )
לקבלת תצמיד מסומן על שטח פני הפאזה המוצקה, וע"י שטיפות ניתן לסלק את המגיב החופשי המסומן . 55

21. עיקרון קיבוע של נוגדן או אנטיגן למשטח מוצק ליצירת משטח ספיחה ספציפי
מבחנות, צלחות ובארות עשויים מפולימר בלתי מסיס בעל מטען חשמלי (פוליסטירן או פוליאתילן) לכן שטח הפנים נוטה לספוח בספיחה חשמלית חומרים שונים בעלי מטען משלהם ( חלבונים , סוכרים ).
קיבוע נוגדן לצורך איתור וכיול אנטיגן ספציפי ע"י ציפוי מבחנות בנוגדן ( coating) :
מכניסים למבחנה תמיסת נוגדן ומדגירים לצורך ספיחה.
מרחיקים את התמיסה ושוטפים עודף נוגדן חופשי שלא נספח.
מוסיפים חלבון אינרטי ( שלא מגיב במערכת נוגדן-אנטיגן הנבדקת) במטרה שגם הוא יעבור ספיחה לאותם אתרים טעונים על המבחנה שנותרו עדיין פנויים . שוב מרחיקים עודף שלא נספח ושוטפים.
המערכת עכשיו יכולה לקשור בצורה ספציפית את אנטיגן המטרה באמצעות הנוגדן ללא חשש לקשירה בלתי ספציפית למשטח הפלסטיק של המבחנה.
4. מוסיפים אנטיגן מסומן למערכת. האנטיגן המסומן נקשר לנוגדנים בקשירה ספציפית.
5. מרחיקים עודף אנטיגן מסומן חופשי שלא נקשר לנוגדנים ע"י שטיפות .
6. נקבל תצמידים מסומנים הקשורים למשטח המוצק.
7. קובעים כמותית את כמות האנטיגן ע"י קביעת כמות הסימון של התצמידים המקובעים. Y Y
Coating ציפוי Y Y Y Y Y Y Y 56

22. א . בוחן רדיואימוני RIA – בוחן המבוסס על סימון רדיואקטיבי
מצפים צלחת או דופן מבחנה באנטיגן בריכוז ידוע וקבוע . שוטפים עודף אנטיגן שלא נספח.
מוסיפים נוגדן בריכוז לא ידוע. הנוגדן נקשר לאנטיגן הספוח . שוטפים עודף נוגדן שלא נקשר.
מוסיפים ליגנד מסומן באיזוטופ רדיואקטיבי שיש לו זיקת קשירה ל Fc של הנוגדן הקשור.
שוטפים עודף חומר מסומן חופשי , שלא נקשר לנוגדן .
קוראים כמות הרדיואקטיביות שנקשרה לנוגדן .
כמות הסימון תהיה ביחס ישר לכמות הנוגדן הנבדק.
יתרונות :
הבוחן הרדיו-אמוני הוא הרגיש ביותר לקביעת נוגדן או אנטיגן.
הספציפיות גבוהה.
מסוגל לזהות אנטיגנים קטנים חד- ערכיים
משמש לקביעה כמותית של הורמונים,ויטמינים,רעלים ותרופות .
חסרונות:
ציוד יקר ועלויות גבוהות
דורש הכשרה מיוחדת
יש דעיכה של הרדיואקטיביות
סיכון עובדים -הסימון באיזוטופ
יוד רדיואקטיבי I 125 , I 131
פחמן או מימן רדיואקטיבי.
אנטיגן Y Y
תצמיד נוגדן-אנטיגן Y
ליגנד מסומן באיזוטופ
נצמד ל נוגדן-אנטיגן 57
שיטת סימון ישירה

23. Y Y Y Y 58 שיטת סימון תחרותית לכיול כמות אנטיגן נעלם
מצפים צלחת או דופן מבחנה בנוגדן בריכוז ידוע וקבוע . שוטפים עודף נוגדן שלא נספח.
מוסיפים אנטיגן מסומן באיזוטופ ( אנטיגן "חם" ) בעודף . האנטיגן המסומן יתקשר לנוגדן הספוח . העודף מבטיח שכל התצמידים יהיו מסומנים. שוטפים אנטיגן שלא נקשר .
מוסיפים אנטיגן נעלם שריכוזו לא ידוע . אנטיגן נעלם לא מסומן ( אנטיגן " קר " )
האנטיגן הקר יתחרה עם האנטיגן החם על הקשירה לנוגדן הספוח. התגובה היא תגובת שיווי משקל דינאמי . מולקולות של אנטיגן קר יכולות להחליף מולקולות של אנטיגן חם, מידת ההחלפה תהיה תלויה בריכוז האנטיגן הנעלם הקר. תהיה ירידה בסימון ביחס למערכת בקרה של 100% סימון.
כמות הירידה בסימון תהיה ביחס ישר לכמות האנטיגן הנעלם.
אנטיגן חם
נוגדן בריכוז קבוע
מוסיפים אנטיגן קר
בריכוז נעלם Y Y Y Y
אנטיגן חם בעודף
אנטיגן קר מחליף
את האנטיגן החם
ויגרום לירידה בסימון 58

24. 59 עיקרון המבחן התחרותי ירידה בכמות הסימון 59

25. ב. בוחן אימונואנזימי על משטח מוצק ( ELISA ) – בוחן המבוסס על סימון אנזימי
עיקרון הסימון ב בוחן EIA : שימוש במולקולת אנזים הקשורה לנוגדן (בחלק ה FC ) או לאנטיגן .
התנאים:
חשוב לקבל תצמידים של נוגדן-אנטיגן . אם אתר ה Fab של הנוגדן ייפגע או אתר האפיטופ שעל האנטיגן ייפגע עקב הסימון , אז לא יווצר תצמיד ולא נוכל להשתמש בשיטה זו.
חשוב לסמן באנזים היוצר תוצר צבעוני בעקבות תגובה עם סובסטרט ספציפי וגורם לשינוי בצבע התמיסה.
יתרונות שיטת הסימון האנזימי על משטח מוצק
( בוחן ELISA ) :
שיטה קלה ופשוטה
שיטה לא מסוכנת (בהשוואה לרדיואקטיבית )
שיטה איכותית וכמותית .
שיטה ויזואלית וניתנת למדידה כמותית בספקטרופוטומטר בהסתמך על עקום כיול
תחומי שימוש ב ELISA לזיהוי ולקביעה של :
הורמונים סטרואידים
נוגדנים לחיידקים ולוירוסים
סמים
חומרים גורמי אלרגיה
שתי צורות בוחן ELISA לקביעת נוגדן או אנטיגן
בוחן תחרותי
בוחן לא-תחרותי (סנדוויץ' )
ירידה בצבע או אי הופעת צבע = תוצאה חיובית
הופעת צבע = תוצאה חיובית 60

26. דוגמה: בדיקת נוגדנים לנגיף האדמת - בוחן אלייזה תחרותי לקביעת נוגדנים בנסיוב חולה
מקבעים אנטיגן בכמות מוגבלת ומדודה למבחנה או באר. שוטפים עודף שלא קובע.
מוסיפים נוגדנים מסומנים בריכוז ידוע + דגימת חולה
הנוגדנים שבדגימת החולה יתחרו עם הנוגדן האנזימי על השירה לאנטיגן המקובע .
שוטפים להרחקת עודף נוגדנים חופשים שלא נקשרו לאנטיגן המקובע.
מוסיפים סובסטרט לאנזים ובודקים יצירת תוצר צבעוני במבחנה או בבאר.
מודדים עוצמת הצבע. מתקבלת ירידה בעוצמת הצבע לעומת הביקורת (ללא דגימת חולה).
ירידה בצבע
ביחס לביקורת
תוצאה חיובית
ביקורת
100%
צבע Y E E Y
אנטיגן מקובע Y E E Y E
תצמיד
נוגדן- אנזימי אנטיגן Y
נוגדן
בוחן אנזימי Y Y E
תצמיד
נוגדן- חולה אנטיגן Y Y E Y
נוגדן
בדגימת חולה 61

27. בדיקה לאנטיגן - בוחן אלייזה תחרותי לקביעת אנטיגן בנסיוב חולה
מקבעים אנטיגן בכמות מוגבלת ומדודה למבחנה או באר. שוטפים עודף שלא קובע.
מוסיפים נוגדנים מסומנים בריכוז ידוע + דגימת חולה
האנטיגנים המסיסים בדגימת החולה יתחרו עם האנטיגן המקובע על הנוגדן האנזימי .
התצמידים שייווצרו יהיו מסיסים וחופשיים ובשטיפות הם יורחקו.
שוטפים. התצמידים שנוצרו בין האנטיגן בדגימת החולה לבין הנוגדן האנזימי יורחקו בשטיפות.
מוסיפים סובסטרט לאנזים ובודקים יצירת תוצר צבעוני במבחנה או בבאר.
מודדים עוצמת הצבע. מתקבלת ירידה בעוצמת הצבע לעומת הביקורת ללא דגימת החולה.
ירידה בצבע
ביחס לביקורת
תוצאה חיובית
ביקורת
100%
צבע Y E E Y
אנטיגן מקובע Y E Y E E
תצמיד
נוגדן- אנזימי אנטיגן Y
נוגדן
בוחן אנזימי Y Y E E
אנטיגן מקובע
ללא נוגדן אנזימי Y E
אנטיגן
בדגימת חולה
נקשר לנוגדן האנזימי
ויוצר תצמיד מסיס חופשי Y E 62
במבחן תחרותי יש ירידה בסימון

28. Y Y Y Y Y בדיקה לנוגדנים - בוחן אלייזה לא -תחרותי ( סנדוויץ' ) 63
בדיקה לנוגדנים - בוחן אלייזה לא -תחרותי ( סנדוויץ' )
מקבעים אנטיגן בכמות מוגבלת ומדודה למבחנה או באר. שוטפים עודף שלא קובע.
מוסיפים דגימת חולה חשוד לנוגדנים . שוטפים .
הנוגדנים בדגימת החולה יתקשרו לאנטיגן המקובע . שוטפים .
מוסיפים נוגדן שניוני ( נגד Fc ) מסומן באנזים. שוטפים נוגדנים מסומנים חופשיים.
הנוגדן השניוני האנזימי יתקשר לנוגדן מדגימת החולה שכבר נקשר לאנטיגן המקובע.
מוסיפים סובסטרט לאנזים ובודקים יצירת תוצר צבעוני במבחנה או בבאר.
מודדים עוצמת הצבע. מתקבלת הופעה או עלייה בעוצמת הצבע לעומת הביקורת ללא דגימת החולה.
אנטיגן מקובע
לא קושר נוגדן שניוני
הופעה או עלייה בצבע ביחס לביקורת
תשובה חיובית
בביקורת לא יופיע צבע Y E Y
נוגדן שניוני
מסומן
תצמיד
נוגדן חולה- אנטיגן
קושר נוגדן שניוני E Y Y Y
נוגדן
בדגימת חולה 63

29. Y Y Y Y Y Y Y Y Y בדיקה לאנטיגן - בוחן אלייזה לא -תחרותי ( סנדוויץ' )
בדיקה לאנטיגן - בוחן אלייזה לא -תחרותי ( סנדוויץ' )
מקבעים נוגדן בכמות מוגבלת ומדודה למבחנה או באר. שוטפים עודף שלא קובע.
מוסיפים דגימת חולה חשוד לאנטיגן . שוטפים .
האנטיגן בדגימת החולה יתקשר לנוגדן המקובע . שוטפים .
מוסיפים נוגדן זהה לנוגדן המקובע מסומן באנזים. שוטפים נוגדנים מסומנים חופשיים.
הנוגדן המסומן - האנזימי יתקשר לאנטיגן החולה שכבר נקשר לנוגדן המקובע.
מוסיפים סובסטרט לאנזים ובודקים יצירת תוצר צבעוני במבחנה או בבאר.
מודדים עוצמת הצבע. מתקבלת הופעה או עלייה בעוצמת הצבע לעומת הביקורת ללא דגימת החולה.
הופעה או עלייה בצבע ביחס לביקורת
תשובה חיובית
נוגדן מקובע
לא קושר נוגדן אנזימי
בביקורת לא יופיע צבע Y Y Y E Y
נוגדן
זהה למקובע
מסומן אנזימי Y E Y E Y Y Y
אנטיגן
בדגימת החולה 64
במבחן לא תחרותי יש עליה בסימון

30. דוגמה לשימוש בבוחן אלייזה לא תחרותי (סנדוויץ') לקביעת נוגדנים ל וירוס HIV
סובסטרט לאנזים
בדיקה חיובית
נוגדן שניוני אנטי FC
קשור לאנזים
נוגדנים מנסיוב חולה
An ELISA plate
אנטיגנים של וירוס
מקובעים למשטח
בדיקה שלילית
Assay Control
Patient C
Patient B
Patient A
Negative Control
Positive Control
0.123
1.999
0.412
O.055
0.153
1.689 65

31. דוגמה לבוחן אלייזה לא תחרותי (סנדוויץ' ) לקביעת נוגדן לנגיף איידס66

32. מכשיר ספקטרופוטומטר קורא תוצאות ELISA
Elisa reader 67

33. אור זורח צבעוני בתחום נראה לעין
ג . בוחן FIA – בוחן המבוסס על סימון פלואורסצנטי
חומר פלואורסצנטי זהו חומר הבולע קרינה באורך גל קצר 280 נ.מ.( UV )
ופולט קרינה באורך גל ארוך ( נראה לעין בתחום נ.מ. )
אור זורח צבעוני בתחום נראה לעין
קרניים UV
אור בלתי נראה לעין
חומר
פלואורסצנטי
גל קצר נקלט
גל ארוך נפלט
שימושים בבוחן FIA :
צביעה ספציפית של חתכי-רקמות לזיהוי אנטיגנים ספציפיים ברקמות.
זיהוי דטרמיננטות על פני תאים מתמיינים, על פני תאים של חולים, ועל תאי סרטן .
יישום במחקר וברפואה . 68

34. Y Y Y שיטת הצביעה של רקמות בעזרת סמן פלואורסצנטי ונוגדנים ספציפיים
סימון ישיר
סימון עקיף (לא ישיר)
מכינים חתך רקמה דק .
מוסיפים נוגדנים ספציפיים לאנטיגן הרקמה הנבדק, לא מסומנים.
שוטפים עודף שלא נקשר .
מוסיפים נוגדן שניוני מסומן בפלואורסצין. שוטפים עודף.
מסתכלים במיקרוסקופ פלואורסצנטי מיוחד, המקרין אור UV , בחדר חושך .
מקומות שקשרו את החומר הפלואורסצנטי יראו זוהרים בעוצמה יותר גדולה.
מכינים חתך רקמה דק .
מוסיפים נוגדנים ספציפיים לאנטיגן הרקמה הנבדק, כשהם מסומנים בפלואורסצין .
שוטפים עודף שלא נקשר .
מסתכלים במיקרוסקופ פלואורסצנטי מיוחד, המקרין אור UV , בחדר חושך .
מקומות שקשרו את החומר הפלואורסצנטי יראו זוהרים בצבע נראה לעין
נוגדן מסומן נגד
אנטיגן רקמה
נוגדן ראשוני נגד
אנטיגן רקמה
נוגדן שניוני
מסומן Y Y Y
חתך רקמה
אנטיגן
רקמה
סימון ישיר
סימון עקיף 69

35. מיקרוסקופ פלואורסצנטי
מיקרוסקופ פלואורסצנטי . פועל בתנאי חושך ומקרין אור קצר (מצויד במנורה אולטרה-סגולית) על התכשיר המיועד לבדיקה .
מסתכלים דרך מגן עיניים (מסנן) ועדשות העין . התמונה נראית באור זורח צבעוני על רקע שחור .
שימוש בסימון פלואורסצנטי כפול ( בו-זמנית בשני חומרים הזורחים באור שונה ) ניתן לאתר
שני אנטיגנים במקביל. הסימון העקיף, הדו-שלבי, מגביר את רגישות הצביעה של הרקמה.
חסרונות ויתרונות הסימון הישיר בהשוואה לסימון העקיף :
השיטה הישירה לא מספיק רגישה.
שיטת העקיפה ( לא ישירה ) יותר רגישה כי נותנת סימון מוגבר 70

36. תרבית תאים פיברובלסטים של אדם נבדקה לנוכחות חלבוני נגיף CMV בגרעינים של התאים המודבקים בבוחן פלואורסצנטי ע"י נוגדנים מסומנים
חלבוני נגיף
בתאים
נצבעו בצהוב זוהר 71

37. 4. שיטת תספיג אימונולוגי (Western blotting ) לזיהוי חלבונים
מפרידים תערובת חלבונים על-פי גודלם באלקטרופורזה בג'ל עם SDS .
מבצעים הספגה והעברה בשדה חשמלי לנייר ניטרוצלולוז .
החלבונים עוברים מהג'ל לנייר ושומרים על מיקומם היחסי בג'ל.
מוסיפים נוגדן ראשוני ספציפי לצביעת חלבון המטרה . שוטפים .
מוסיפים נוגדן שניוני אנטי FC של הנוגדן הראשוני מסומן באנזים . שוטפים עודף.
מוסיפים סובסטרט הנותן תוצר צבעוני בלתי מסיס, בעקבות פעילות האנזים עליו.
מתקבל פס שקיעה של תוצר צבעוני ( כחול ) בלתי מסיס ( צביעה אימונואנזימית ).
**אפשר להוסיף נוגדן שניוני מסומן באיזוטופ רדיואקטיבי (קביעה באוטורדיוגרפיה ע"י חשיפה לסרט צילום ופיתוח) , ואז מתקבלים פסים שחורים. משווים לסולם סמנים בעלי מסה מולרית ידועה. E
נוגדן שניוני
מסומן באנזים Y Y
נוגדן ראשוני
נגד חלבון המטרה
שיטת תספיג אימונולוגי משמשת ל :
זיהוי חלבונים מבוקשים בדגימה
בדיקת איכות הפרדה וניקוי של חלבונים
זיהוי גורמי מחלות
חלבון המטרה
אחרי אלקטרופורזה 72

38. אימונובלוט אימונואנזימי
העשרה
אימונובלוט בשיטת אוטורדיוגרפיה
אימונובלוט אימונואנזימי
של חלבוני HIV 73

39. העשרה
דוגמה בשיטת אימונובלוטינג : אבחון מחלת האיידס על-פי זיהוי חלבוני נגיף HIV 1 2 3 4 5
הפרדת החלבונים
ע"י הרצה חשמלית
בג'ל+SDS
פירוק מעטפת
בעזרת SDS
הספגה לנייר
והוספת נוגדן
ראשוני IgG
ספציפי לחלבון
הנגיף
הוספת נוגדן
שניוני אנטי IgG
מסומן באנזים
וקבלת פסי שקיעה
צבעוניים על הנייר
נגיף HIV 74

40. מבחן המאגלוטינציה לקביעת סוג הדם
העשרה
מבחן המאגלוטינציה לקביעת סוג הדם 75

41. דוגמה לאגלוטינציה לא ישירה = פסיבית
העשרה
דוגמה לאגלוטינציה לא ישירה = פסיבית
קביעה וכיול כמותי של נוגדנים לחיידק העגבת בנסיוב חולים
גרף כיול
ביקורות שלילית
5 - 19
נסיובי חולים +
כדוריות מצופות
זהו טסט הבדיקה
נסיובי חולים
+ כדוריות לא מצופות
זוהי בקרת טסט
המטרה: איתור הנוגדנים לסיפיליס = נגד החיידק T.Pallidum
נסיובים שנמצאו חיוביים לנוכחות הנוגדנים הם : 10 ,12 , 16, 17, 18 . 76

42. העשרה
אבחון איידס - ערכה לבדיקה ביתית לנוכחות נוגדנים ל HIV בדם (תוך 10 דקות) 1 2 3 4 5
שלילי
חיובי 6
פס בקרה
פס טסט חיובי 77

43. העשרה מבחן ELISA לאבחון HIV 78 http://www.unilatex.com/elisa-test.htm 78