1. Detoxikace endogenních a exogenních látek mirka.rovenska@lfmotol.cuni.cz

2. A) DETOXIKACE AMONIAKU Amoniak pochází z katabolismu aminokyselin a ty především z odbourávání proteinů – jak přijatých potravou, tak endogenních:  trávicí enzymy  proteiny pocházející z odloučených buněk povrchu GIT  svalové proteiny  hemoglobin  intracelulární proteiny (poškozené, nepotřebné)

3. Odstranění dusíku z aminokyselin

4. Amoniak musí být odstraňován: Amoniak je toxický, zejména pro CNS, protože reaguje s 2-oxoglutarátem, a tak snižuje jeho dostupnost pro citrátový cyklus  kolaps CC a následně i syntézy ATP Při poškození jater nebo vrozené metab. poruše (stoupá konc. amoniaku) se může objevit třes, nezřetelná řeč, rozmazané vidění, koma a smrt Normální konc. amoniaku v krvi: 30-60 µM

5. Transaminace Přenos aminoskupiny aminokyseliny na 2-oxokyselinu  původní AA se mění na 2-oxokyselinu a naopak:

6. pyruvát glutamát2-oxalacetát

7. Transaminaci katalyzují transaminasy (aminotransferasy) s koenzymem pyridoxalfosfátem: aminokyselina pyridoxalfosfátSchiffova báze

8. Hlavní transaminasy: Alaninaminotransrefasa (ve svalu): AA + pyruvát  2-oxokyselina + Ala Glutamátaminotransferasa: AA + 2-oxoglutarát  2-oxokyselina + Glu Aspartátaminotransferasa: AA + oxalacetát  2-oxokyselina + Asp Transaminace jsou většinou zvratné  mohou běžet oběma směry v závislosti na konc. reaktantů

9. Výsledek: Transaminasy mají různou substrátovou specifitu, většina z nich ale jako oxokyselinu používá 2-oxoglutarát, v menší míře též oxalacetát  produkty jsou převážně Glu a Asp – v nich se transaminacemi hromadí dusík z AA!!!  Glu je buď oxidačně deaminován za vzniku NH 3, který v játrech vstupuje do močovinového cyklu, nebo využit pro syntézy  Aspartát v játrech rovněž vstupuje do močovinového cyklu

10. Oxidační deaminace glutamátu V mitochondriích Glu + NAD(P) + + H 2 O → NAD(P)H + H + + NH 4 + + 2-oxoglutarát Reakce může v závislosti na konc. reaktantů běžet oběma směry – jak k tvorbě Glu, tak k uvolnění a detoxikaci amoniaku. Reakci katalyzuje glutamátdehydrogenasa, která může využívat NAD + i NADP+ Uvolněný amoniak je detoxikován v močovinovém cyklu

11. Transport amoniaku do jater a ledvin: 1) ve formě Gln V tkáních je amoniak zabudován do Gln: Glu + ATP + NH 4 +  Gln + H 2 O + ADP + P Reakci katalyzuje glutaminsynthetasa; Gln je transportován do jater a ledvin a zde deaminován L-glutaminasou → vzniká Glu a amoniak: Vzniká Glu, který může být oxidačně deaminován, a amoniak, který je v ledvinách vyloučen močí, v játrech detoxikován v moč. cyklu – odstraňuje amidoskupinu, ne  -aminoskupinu!!!

13. Gln v ledvinách Gln z tkání nemusí být kompletně rozložen v játrech na Glu a amoniak; část Gln se dostává do ledvin a je glutaminasou rozložena tady; přispívá i Gln tvořený v ledvinách V ledvinách ovšem uvolněný amoniak nevstupuje do močovino- vého cyklu, nýbrž je vyloučen do moče To má význam pro regulaci acidobazické rovnováhy a pH moče

14. 2) Ve formě Ala: Pyruvát, vznikající glykolýzou ve svalu, je tu transaminován na Ala a ten krví přenesen do jater, kde je přeměněn zpět na pyruvát. NH 3 vstupuje do močovinového cyklu, pyruvát do glukoneogeneze; vytvořená glukosa je přenesena zpět do svalu. Transaminaci Glu + pyruvát → Ala + 2-oxoglutarát využívají i další tkáně k transportu dusíku ve formě Ala!!! JátraSval – především v tzv. glukoso-alaninovém cyklu:

15. Detoxikace amoniaku a) zabudováním do Glu (glutamátdehydrogenasou) a Gln (glutaminsynthetasou): 2-oxoglutarát + NH 4 + + NAD(P)H+H +  Glu + H 2 O + NAD(P) + Glu + ATP + NH 4 +  Gln + H 2 O + ADP + P  Glu, Gln se pak využívají pro další syntézy: Glu – syntéza Gln, Pro, Ala, Asp Gln – syntéza bází NA  Transaminace Glu + oxalacetát → Asp + 2-oxoglutarát v játrech poskytuje Asp pro močovinový cyklus!!! b) močovinový cyklus přeměňuje amoniak na močovinu, která je vyloučena močí…HLAVNĚ

16. Zdroje NH 3 pro moč. cyklus – shrnutí: Oxidační deaminace Glu, nahromaděného transaminacemi a glutaminasovou reakcí; vzniká 2-oxoglutarát a amoniak, který v játrech vstupuje do močovinového cyklu Glutaminasová reakce – uvolňuje amoniak, který v játrech vstupuje do močovinového cyklu (v ledvinách do moče) Katabolismus Ser, Thr a His rovněž uvolňuje amoniak: Amoniak produkují také střevní bakterie Analogicky: Thr na 2-oxobutyrát urokanát – NH 3 serindehydratasa

17. Močovinový cyklus Detoxikace amoniaku probíhá v močovinovém cyklu, který přemě- ňuje amoniak na močovinu (vylučována močí) V játrech, ve 2 kompartmentech: mitochondriální matrix a cytoplasmě V matrix mitochondrií probíhá oxidační deaminace Glu a uvolněný amoniak je zde přeměněn na karbamoylfosfát: NH 4 + + HCO 3 - + 2 ATP  2 ADP + P+ Karbamoylfosfát v mitochondriích reaguje s ornithinem za vzniku citrullinu, který je přenesen do cytoplasmy; regenerovaný ornithin (krokem 5) je přenesen zpět do mitochondrií karbamoylfosfát

18. Fumarate ← Glu + oxalacetát

19. Bilance močovinového cyklu: V močovinovém cyklu se spotřebovávají 3 moly ATP na 1 mol močoviny:  2 na tvorbu karbamoylfosfátu  1 na tvorbu argininosukcinátu

20. Tvorbu karbamoylfosfátu katalyzuje karbamoylfosfátsynthetasa I (CPSI), jejímž aktivátorem je N-acetylglutamát: N-Ac-Glu je syntetizován z Glu a AcCoA, reakci stimuluje Arg Větší odbourávání AA (tj. stoupá potřeba odstraňovat dusík)  stoupá konc. Glu (transaminacemi) a Arg  stoupá i koncentrace N-Ac-Glu  aktivace CPS I, a tím stimulace močovinového cyklu Regulace na úrovni CPSI

21. Deficience enzymů moč.cyklu Vedou ke zvýšení hladin Gln a amoniaku v krvi 1) N-acetylglutamátsynthetasa Léčba: podává se karbamoylglutamát – také aktivuje CPSI 2) CPSI Léčba: podává se benzoát a fenylacetát, vzniklý hippurát a Phe-Ac-Gln se vyloučí močí:

22. 3) Ornithintranskarbamoylasa – nejobvyklejší porucha Léčba jako u 2) (tj. odstranění dusíku ve formě Gly a Gln) 4) Argininosukcinátsynthetasa: v krvi se akumuluje citrulin a dostává se do moče (citrulinemie) Je nutno dodávat Arg 5) Argininosukcinátlyasa Terapie: jako u 2) + dodávání Arg 6) Arginasa: vzácná porucha; Arg se akumuluje a je vylučován. Léčba: podává se benzoát a nízkoproteinová dieta obsahující esenciální AA s výjimkou Arg, příp. jejich ketoanalogy Ve všech případech se nasazuje dieta s nízkým obsahem dusíku

23. Další dusíkaté degradační produkty vylučované močí Kreatinin – vzniká z kreatinfosfátu: Kyselina močová – vzniká katabolismem purinových bází kys. močová

24. B) Metabolismus xenobiotik Léky, konzervanty, barviva, pesticidy… Hlavně v játrech, dále ve střevech, ledvinách, plicích Probíhá ve dvou fázích

25. Fáze 1 Zavedení nové funkční skupiny nebo modifikace stávající Probíhá hlavně v endoplasmatickém retikulu (ER) Výsledek:  zvýšení polarity (tj. usnadnění exkrece)  změna biologické aktivity: A) snížení biologické aktivity (toxicity) B) aktivace: některé látky jsou naopak až fází 1 přeměněny na biologicky účinnou (toxickou) formu

26. Možné nežádoucí účinky aktivovaných xenobiotik Cytotoxické působení, např. kovalentní vazbou na proteiny Vazba na protein  následně rozpoznán jako antigen  tvorba protilátek  poškození buňky Karcinogeneze – fáze 1 aktivuje prokarcinogeny (např. benzpyren). Protektivně může působit epoxidhydrolasa v ER: přeměňuje vysoce reaktivní, mutagenní a/nebo karcinogenní epoxidy na méně reaktivní dioly: epoxid diol

27. Reakce fáze 1: Hydroxylace Tvorba epoxidu Redukce ketoskupin a nitroskupin Dehalogenace

28. Hydroxylace Hlavní reakce fáze 1 Katalyzována cytochromy P450:  u člověka asi 60 různých isoforem; nejhojnější: CYP3A4  jde o monooxygenasy: RH + O 2 + NADPH + H +  ROH + H 2 O + NADP +  Elektrony jsou z NADPH+H + přeneseny na NADPH:cytochrom P450 reduktasu a tou pak na cytochrom P450, který je využívá k aktivaci molekulárního kyslíku. Jeden kyslíkový atom je pak zabudován do substrátu.  Metabolizují nejen xenobiotika, ale též endogenní látky, např. některé eikosanoidy, steroidy!!!

29. Isoformy cytochromu P450 Hemoproteiny V endoplasmatickém retikulu nebo vnitřní mitoch. membráně Nejhojnější – v játrech a tenkém střevě, dále v plicích; v játrech je nejméně 6 isoforem a každá má širokou substrátovou specifitu Označení isoforem (rodina, podrodina – podle identity AA sekvence: CYP3A4 U některých se vyskytují polymorfní formy, které mohou mít sníženou aktivitu  zvýšená hladina příslušných xenobiotik v těle Některé isoformy metabolizují polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs), a tak hrají roli v karcinogenezi (např. konverze inaktivních PAHs, inhalovaných při kouření, na aktivní karcinogen v plicích) CYP = cytochrom P450 3…rodina A…podrodina 4…číslo isoformy v dané podrodině

30. Většina isoforem je inducibilních: Např. fenobarbitalem a jinými léky, ale také svými substráty Mechanismus: nejčastěji zvýšená transkripce Může vést k interakci s podávanými léčivy: indukce dané isoformy lékem 1 (např. fenobarbitalem) zrychlí metabolismus léku 2 (např. warfarin) touto isoformou  pro žádaný účinek je nutno zvýšit dávku léku 2

31. Metabolismus ethanolu Hlavně v játrech, účinkem dvou dehydrogenas (hlavní cesta): Další dráha (~10-20%): isoforma cytochromu P450 CYP2E1: CH 3 CH 2 OH + NADPH+H + + O 2 → NADP + + 2 H 2 O + CH 3 CHO Je-li množství acetaldehydu zvýšené, dostává se do krve a může poškodit tkáně. CYP2E1 je indukován ethanolem a metabolizuje i některé karcinogenní složky tabákového kouře! Většina acetátu vstupuje do krve a, hlavně v kosterním svalu, je aktivována na acetyl-CoA, který je oxidován v citrátovém cyklu

32. Fáze 2 – konjugace Látky vzniklé ve fázi 1 jsou konjugovány s jinými molekulami:  glukuronátem  sulfátem  glutathionem Konjugace ještě více zvýší rozpustnost ve vodě, příp. sníží aktivitu Ve formě konjugátu jsou látky vyloučeny z těla buď žlučí (látky s M r  300) nebo močí (látky s M r  300)

33. Glukuronidace Donorem glukuronátu je UDP-glukuronová kyselina: Glukuronát může být připojen na kyslíkaté (O-glukuronidy) či dusíkaté skupiny (N-glukuronidy) Jako glukuronidy jsou vylučovány např.: kys. benzoová, fenol, meprobamat, ale také endogenní látky – bilirubin, steroidní hormony glukuronát

34. Vylučování bilirubinu Bilirubin je produktem katabolismu hemu hem

35. transport do jater pomocí albuminu M: methyl, V: vinyl, CE: karboxyethyl (propionyl)

36. V játrech: bilirubin + 2 UDP-glukuronát bilirubindiglukuronid + 2 UDP vyloučen do žluče bakteriální enzymy v tlustém střevě uvolňují bilirubin z diglukuronidu a přeměňují ho především na urobilinogen část reabsorbována, přenesena do ledvin a přeměněna na žlutý urobilin vylučovaný močí většina přeměněna bakteriemi na červenohnědý sterkobilin zbarvující stolici bilirubindiglukuronid

37. Sulfatace Některé alkoholy, arylaminy, fenoly, ale také steroidy, glykolipidy, glykoproteiny Donorem sulfátu je PAPS (3´-fosfoadenosin-5´-fosfosulfát):

38. Konjugace s glutathionem Glutathion (GSH) =  -glutamylcysteinylglycin: Konjugace s glutathionem: G–S–H + R → G–S–R + H + (R…elektrofilní xenobiotikum) S GSH je konjugováno několik potenciálně toxických xenobiotik – konjugace tak zabraňuje vazbě xenobiotika na DNA, RNA či protein, a tím i poškození buňky!

39. Další přeměny konjugátů s GSH: Konjugát s glutathionem je dále přeměňován:  jsou odstraněny glutamyl a glycinyl z GSH  je připojen acetyl (z acetyl- CoA) na aminoskupinu Cys vzniká kyselina merkapturová (konjugát acetylcysteinu), která je vyloučena močí kys.merkapturová

40. C) Metalothioneiny Malé proteiny ( ~ 6,5 kDa) bohaté na cystein, jehož – SH skupiny vážou ionty kovů: Cu 2+, Zn 2+, Hg 2+, Cd 2+ V cytosolu buněk hlavně jater, ledvin a střev Indukovány ionty kovů Funkce: navázání kovů, regulace hladiny Zn 2+, transport do místa potřeby (Zn 2+ )