1. Metano monoossigenasi solubile  MMO nei batteri metanotrofi esiste sia in forma solubile che insolubile.  Alcuni microorganismi producono la forma solubile o insolubile a seconda delle condizioni di crescita (concentrazione del rame), altri solo la forma insolubile. La forma solubile è stata isolata e caratterizzata Idrossilasi (MMOH)PM 245000 Componente B (MMOB)PM 15000 Riduttasi (MMOR) PM 40000

2. Idrossilasi e sue proprietà spettroscopiche  E’ costituita da 6 subunità (  2  2  2 ).  La subunità  contiene un centro binucleare con ioni ferro collegati da un ponte a OH.  Nello stato di riposo il cluster è nello stato diferrico [Fe III -Fe III .  Può accettare 1 o 2 elettroni per dare la valenza mista [Fe III -Fe II  o lo stato diferroso [Fe II -Fe II .  La forma ridotta è quella che lega O 2 e dà inizio al ciclo catalitico Proprietà spettroscopiche: Forma ossidata: 2 ioni Fe 3+ (S=5/2) antiferromagneticamente accoppiati per dare un centro diamagnetico EPR silente Dati EXAFS indicano una distanza Fe-Fe > 3 Å. Dati Mossbauer indicano una costante di accoppiamento Fe-Fe più debole che nel caso di  -oxo-bridged clusters.

3. Idrossilasi: proprietà spettroscopiche Forma semiridotta: 2 ioni Fe 3+ e Fe 2+ (S=5/2 e S=2) per dare una specie antiferromagneticamente accoppiata con S = ½ - EPR g av < 2 Forma ridotta: 2 ioni Fe 2+ (S=2) ferromagneticamente accoppiati per dare una specie con stato fondamentale S = 4. - EPR g av = 16 -Dati Mossbauer indicano che i 2 ioni ferro sono in intorni simili, ma distinguibili. -Spettri CD e MCD indicano che ogni ione ferro è 5-coordinato con geometria piramidale quadrata distorta. -Dati EXAFS indicano che i 2 ioni ferro sono più lontani che negli altri stati di ossidazione -e possono essere meno fortemente accoppiati. Ciò è in accordo con la struttura cristallina che indica la perdita del ponte idrossido 2+

4. Struttura cristallografica La struttura della forma ossidata è nota sia per l’idrossilasi da Methylococcus capsulatus che da Methylosinus trichosporium Forma ossidata Il centro binucleare risiede in un centro costituito da un “4-helix bundle” con 2 segmenti Glu-X-X-His che servono come leganti degli ioni ferro.

5. Nella forma ossidata ogni ione ferro è esa-coordinato con un N istidinico e 5 O come leganti. I dettagli variano a seconda dell’enzima e delle condizioni sperimentali Maarten Merkx et al., Angewandte Chemie International Edition, 2001, 40:2782-2807

6. Centro binucleare nella forma ossidata e ridotta   In seguito a riduzione il Glu 243 subisce il cosiddetto “shift del carbossilato”, ovvero passa da una posizione terminale, come monodentato su il Fe2, a legante monodentato a ponte tra i 2 ioni ferro. Uno dei 2 ponti OH viene perso e l’altro diventa legante terminale su Fe1. Fe 2+ 5-coordinato  Non è stato individuato un vero e proprio canale verso l’interno della proteina.  L’ingresso del substrato puo’ essere dipendente dalla flessibilità della proteina o dall’interazione con MMOB e MMOR per creare un canale di entrata.

7. Riduttasi (MMOR) e componente B (MMOB) Riduttasi  Contiene sia FAD che un centro Fe 2 S 2.  Ossida il NADH. Gli e - vengono trasferiti al sito diferrico dell’idrossilasi attraverso il FAD e il centro Fe 2 S 2.  La MMOR interagisce con MMOH modificandone la struttura o la reattività, attraverso la formazione di un complesso con la subunità . Componente B  Non contiene cofattori o centri metallici.  MMOB interagisce con la subunità  della MMOH.  La formazione del complesso ha effetti sulla velocità delle reazioni del ciclo catalitico, sulla struttura della MMOH.

8. MMOR: struttura dei domini che legano NAD e FAD (A)The backbone atoms (N,C,C) of the 10 lowest energy NMR-derived structures are displayed in stereoview (residues 10-251). Secondary structural elements are shown colored in cyan ( sheet) and red ( helix). (B) Ribbon diagram and nomenclature of FAD- and NADH-domains, with bound FAD cofactor shown in blue at the interface between the two domains. NAD domain FAD domain

9. MMOR: struttura del dominio che contiene il centro Fe-S (A)Stereoview of the backbone atoms (N, C, and C) of 10 superimposed NMR-derived structures of MMOR-Fd (residues 3-96). strands and helices are shown in blue and red, respectively. (B) Ribbon diagram of MMOR-Fd in the same orientation

10. Ribbon diagram of the structure including terminal regions, the orientations of which are not defined. MMOB structure

11. Effetti regolatori della riduttasi e della componente B MMOR: la sua interazione con la subunità  della MMOH ne modula il potenziale in modo da permettere il trasferimento degli elettroni a MMOH MMOB: la sua interazione con la subunità  della MMOH permette alla forma ridotta di MMOH di interagire rapidamente con O 2 e facilita l’interconversione degli intermedi per dare il composto Q, che interagisce direttamente con il substrato Come MMOB modula la reattività per O 2 ? Induce cambiamenti conformazionali in MMOH, di lieve entità aumentando l’accessibilità al sito metallico binucleare. Il sito binucleare è schermato dal solvente da 2 eliche, contenenti 4 AA legati al ferro, che confinano con un canale aperto dove interagiscono le altre componenti. Ogni perturbazione in queste eliche, per es. causata dall’interazione con MMOB, può alterare l’intorno del cluster binucleare L’azione combinata di MMOR e MMOB rende ottimale l’attività catalitica

13. A surface diagram model for docking MMOB (top) into the canyon of MMOH (bottom). Each subunit of MMOH is distinguished by color, whereas MMOB is colored according to binding data. Residues of MMOB most affected are colored blue and those least affected are red. For clarity, MMOB has been translated away from its proposed docking site on the surface of the hydroxylase and rotated clockwise about the y- axis by 90° to expose residues most involved in binding.

14. Studi genetici  Il cluster di geni della MMOH, MMOR, MMOB è stato sequenziato e clonato sia per le proteine da Methylococcus. capsulatus che Methylosinus trichosporium.  MMOH, a differenza di MMOR e MMOB, non viene espressa singolarmente in forma attiva.  L’intero cluster di geni è stato clonato con successo in E. coli, e in Pseudomonas.  Il batterio ricombinante ha bassa attività nei confronti del metano, ma può ossidare altri substrati come tricloroetilene.

15. Sequenza degli intermedi di reazione  Il ciclo comincia con la riduzione dello ione Fe 3+ a Fe 2+. In assenza di substrato Q si forma più rapidamente di quanto decada Composto O - Mantiene il segnale EPR g = 16, dello stato diferroso. E’ l’addotto che si forma per interazione di O 2 nel sito attivo, prima di legarsi al ferro Composto P – Non mostra segnali EPR. Dati Raman evidenziano frequenze di stretching tipiche di specie perossidiche Dati Mossabauer evidenziano la presenza di 2 ioni Fe 3+ con l’ossigeno legato in maniera simmetrica Composto Q – Dati Mossbauer indicano la presenza di 2 ioni Fe(IV) antiferromagneticamente accoppiati. In assenza di substrato si forma più rapidamente di quanto decada. Composto R – E’ un intermedio a vita breve che deriva dall’astrazione di un atomo di H dal substrato, formando la specie radicalica del substrato Composto T – E’ l’addotto terminale enzima-prodotto. Il rilascio del prodotto è il passaggio limitante la velocità di reazione.

16. Intermedi del ciclo catalitico

17. Ciclo catalitico della MMO E. G. Kovaleva, M.B. Neibergall, S. Chakrabarty, J. D. Lipscomb Acc. Chem. Res. 40:475-483, 2007

18. Proposed structures of sMMO P and Q from spectroscopic studies. The precise structures of these compounds have not been definitively established (Tinberg & Lippard, 2011).

19. Altre monoossigenasi con un cluster binucleare a ferro Toluene monoossigenasi  T2MO ( o-cresolo) Isolata da Burkholderia cepacia E’ costituita da 3 componenti Idrossilasi (  ) 2 PM 211000 Riduttasi (FAD + Fe 2 S 2 ) PM 40000 Componente B PM 10400 L’idrossilasi contiene un centro binucleare Fe-Fe  T3MO ( m-cresolo) E’ stato identificato il gene, ma non è stato isolato l’enzima  T4MO ( p-cresolo) Isolata da P. mendocina e espressa in E. coli E’ costituita da 4 componenti Idrossilasi (  ) 2 PM 220000 Ferredossina [Fe 2 S 2 )  R PM 36000 Riduttasi (FAD + Fe 2 S 2 ) PM 36000 Componente B PM 11600 L’idrossilasi nello stato ossidato ha un centro Altri sistemi contenenti centri metallici binucleri (Fe)  Fenolo Idrossilasi  Xilene monoossigenasi  Alcano idrossilasi

20. pMMO E’ costituita da 3 tipi di subunità pmoB (  47000 Da) pmoA (  24000 Da) pmoC (  22000 Da) La composizione in metalli è stata oggetto di un lungo dibattito: Riportati 2-15 Cu per complesso (3-4 sulla base della struttura del 2005) 0-2 Fe (0 sulla base della struttura del 2005) 2 ioni Cu in un sito binucleare, più eventualmente un terzo ione di tipo II, sulla base di studi spettroscopici e di biologia molecolare (2010, probabilmente conclusivo)

21. Rame proteine Type I Cu Type II Cu Type III Cu Uncoupled Coupled Cu A Cu His OH 2 His

22. Struttura di pMMM da Methylococcus capsulatus Le subunità sono organizzate in un trimero  3  3  3 che forma una struttura di tipo cilindrico Zona solubile Eliche transmembrana La parte solubile dell’apertura al centro del trimero si affacciano residui idrofilici come Glu, Asp e Lys, che stabilizzano il trimero.

23. Struttura e subunità della pMMO Subunità A. Prevalentemente TM. Consiste di 7 eliche che Interagiscono con quelle della subunità B. Una corta elica esce dalla membrana e interagisce con la parte solubile della subunità B. Subunità C Contiene 5 elicvhe TM Orientate parallelamente, di circa 29 residui ciascuna Subunità B Comprende 2 strutture a  barrel, una all’estremità N e una C terminale, nella parte solubile della proteine. I 2  barrel sono separati da 2 eliche TM. La subunità B contiene un centro binucleare a Cu nell’estremità N-terminale.

24. Sito di Zn, proposto legare due ioni Fe in vivo Proposto sito di legame per cluster di rame trinucleare Lieberman, R.L., Rosenzweig, A.C. (2005) Nature 434: 177-182

25. Confronto tra le subunità B di pMMO (magenta) e la subunità II della citocromo C ossidasi (verde) da P. denitrificans

26. I centri metallici Altri possibili siti di binding dei metalli: Siti avventizi Met 42, Asp 47, Asp 49, Glu 100 della subunità pmoA e Glu 154 della subunità pmoC

27. Dimostrazione che il sito dinucleare è quello attivo (I) L’enzima as-isolated e demetallato torna attivo con tre equivalenti di rame Epossidazione del propilene Monoossigenazione del metano Balasubramanian, …, Rosenzweig (2010) Nature 465: 115-119

28. Il dominio solubile della subunità  è attivo. La mutazione di un aminoacido che lega il rame mononucleare riduce ma non elimina l’attività Dimostrazione che il sito dinucleare è quello attivo (II) Epossidazione del propilene Monoossigenazione del metano

29. Il meccanismo è ignoto Dx: intermedio di reazione (l’ossidante) proposto su considerazioni teoriche: Cu(II)Cu(III)(  - (O) 2 ) Oppure più semplicemente Cu(II)Cu(II)(  -(O))

30.  E’ un enzima le cui varianti sono presenti in mammiferi, piante, batteri, lieviti, insetti, ecc. Un singolo organismo può conterne molteplici varianti  Ruolo: - idrossilazione di substrati endogeni (acidi grassi, aminoacidi, ormoni) - idrossilazione di sostanze xenobiotiche  Enzima di membrana (più raramente solubile, es: P450 cam) COLECALCIFEROLO VIT D3 1,2,5-DIIDROSSICOLECALCIFEROLO  - NAFTILAMMINA  IDROSSI-  - AMMINONAFTALENE (carcinogeno) Citocromo P450

31. Reazioni catalizzate M. Sono, M.P. Roach, E.D. Coulter and J.H. Dawson, Heme-containing oxygenases, Chem. Rev. 96 (1996), pp. 2841–2888

32. Struttura a raggi X P450 cam 414 AA, PM 45000 Eme in intorno idrofobico senza nessuna esposizione all’esterno. La regione in nero (a dx) mostra le zone coinvolte nel riconoscimento del substrato. G. Denisov, T.M. Makris, S.G. Sligar and I. Schlichting, Structure and chemistry of cytochrome P450, Chem. Rev. 105 (2005), pp. 2253–2277

33. Cit P 450 : classi RH + O 2 + NAD(P)H + H + ROH + H 2 O + NAD(P) + All known P450s are multi-centre enzymes consisting of a heme, or P450, component with associated reductase components. Mitochondrial and most bacterial P450s are three component systems, comprising a P450, a ferredoxin and a NADH-dependent, FAD-containing ferredoxin reductase (class I). The microsomal P450s (class II), are two component systems, both membrane bound, with a NADPH-dependent diflavin reductase (FAD and FMN) and P450. Class III P450s, such as P450 BM3 from Bacillus megaterium, contain the same cofactors as the class II P450s but are soluble and fused into one continuous polypeptide. Class IV P450s, contained in Rhodococcus, are also soluble, one component enzymes but contain an NADPH-dependent, FMN-containing reductase and ferredoxin fused to the heme domain. A schematic of these classes is shown below. Batterico e mitocondriale, ma nei mitocondri solo la ferredossina è solubile, le altre due proteine sono legate alla membrana interna

34. Citocromi P450 di mammiferi coinvolti nella degradazione di composti xenobiotici

35. Il tamoxifen è un farmaco impiegato nella cura e prevenzione del tumore del seno I principi realmente attivi sono alcuni suoi derivati metabolici, prodotti in seguito all’azione di diversi isoenzimi del citocromo P450

36. Valori di logP per alcuni substrati dei citocromi P450

37. P450 cam (P. putida)  414 AA, PM 45000  Eme posto tra 2 eliche. Assenza di legami covalenti con la proteina Low spin (Resting state) S=1/2 High spin (Lega O 2, CO) S=2 III II, e-

38. Interazione con il substrato  Il legame con la canfora è accompagnato dall’allontanamento di alcune molecole di acqua dalla cavità dove si posiziona la canfora  La cavità per il substrato è formata da aminoacidi idrofobici. Fa eccezione la Tyr-96 che forma legame a H con CO in posizione 2 della canfora.  Il substrato viene stabilizzato per effetto di interazioni idrofobiche (8-CH 3, 9-CH 3 e Val-295)  Analogie nella sequenza dei citocromi P 450 : -regione comprendente Cys assiale -regione comprendente Thr (252 per P 450 cam) che interagisce con O 2 nel complesso P 450 -O 2.

39. Meccanismo di reazione H.S. E°=-170mV. L’aumento del potenziale cresce col crescere dell’affinità fra la tasca e il substrato L.S. E°=-330mV from putidaredoxin (Fe(II)-O 2 )

40. Struttura cristallografica di 4

41. Rottura eterolitica del gruppo perossidico III IV + OH - 2- “0” Un elettrone è donato dalla porfirina, che prende carica +1

42. Ciclo veloce e disaccoppiamento tra trasferimento di e - e di ossigeno Ciclo veloce  Alcuni donatori di atomi di ossigeno come perossidi, peracidi, NaIO 3, NaClO 2, possono sostituire i 2 e - e l’O 2 richiesti per il ciclo normale e generare direttamente, l’intermedio (6).  Alcuni citocromi P450 possono utilizzare direttamente H 2 O 2 e formare l’intermedio (5b). Disaccoppiamento tra trasferimento di e - e di ossigeno  E’ possibile avere trasferimento elettronico senza trasferimento di ossigeno al substrato per protonazione di (5b) IV + III IV H2OH2O H2O2H2O2 2 H +, 2 e - H+H+ III o per protonazione di (6)

43. Rottura del legame O-O  La specie reattiva osso-ferrile viene ottenuta per riduzione del complesso superossido-Fe(III) seguita da doppia protonazione dell’atomo esterno per ottenere Fe(III)-OH 2 e poi indurre la rottura eleterolitica del legame O-O. Condizioni per la rottura eterolitica Effetto di spinta da parte del legante Cys  Il carattere di forte elettron donatore della Cys coordinata al ferro in posizione assiale facilita la rottura del legame O-O. Quando il legame O-O è eteroliticamente rotto, il legante assiale, elettron donatore, stabilizza l’elevato numero di ossidazione della specie osso-ferrile IV

44. Meccanismo push-pull Meccanismi push-pull per la rottura del legame O-O di un ferro-perossido nel caso di un sistema con un gruppo tiolato (P450) e con un gruppo istidinato (perossidasi)

45. Rilascio di protoni da parte dei gruppi in posizione distale 251 252  E’ necessaria una “sorgente” di protoni per permettere all’ossigeno esterno del perossido di allontanarsi come acqua. Due aminoacidi, Thr 252 e Asp 251, sono coinvolti nel processo, formando una rete di rilascio di protoni. Insieme a 2 residui carichi (Arg e Lys) consentono il trasferimento di protoni dal solvente, in superficie, al sito attivo.

46. Intermedio reattivo  Altre formule risonanti per l’intermedio (P. + ) IV  L’intermedio è una specie altamente elettrofila. Preferenzialmente reagisce con atomi di C elettron ricchi (C-terziari  -secondari  -primari) Trasferisce un atomo di ossigeno neutro al substrato (P. + ) IV + RHFe(P) + ROH III

47. Applicazioni biotecnologiche Produzione di composti complessi Mutante F87W/Y96F/V247L di P450cam Bell SG et al., J. Am. Chem. Soc., 125: 705 -714, 2003

48. Georg Zocher; Martin E. A. Richter; Uwe Mueller; Christian Hertweck; J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 2292-2302. Applicazioni biotecnologiche II

49. A serine-substituted P450 catalyzes highly efficient carbene transfer to olefins in vivo Coelho PS et al., Nature Chemical Biology, 2013 La mutazione del legante assiale rende possibile la riduzione con NADH (i.e. abolisce il bisogno della riduttasi) e azzera la capacità di effettuare monossigenazione. La resa è dell’ordine dei g/litro in E. coli.