1. Microalgas para Biodiesel – Colheita de biomassa e extracção de óleos VALTER Mendes RAMALHO Orientação: Doutora Luísa Gouveia Co-orientação: Professor Doutor Nuno Lapa Dissertação apresentada à Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Energia e Bioenergia 1Caparica, 4 de Novembro de 2009

2. 2 i. Objectivo ii.Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões 1. De entre um conjunto de métodos de colheita de biomassa, identificar o mais eficaz para as microalgas Neochloris oleoabundans e Nannochloropsis sp. 2. Optimização das condições de operação para cada um dos métodos de colheita estudados. 3. De entre um conjunto de métodos de extracção de óleos, identificar o mais eficaz para as microalgas Neochloris oleoabundans e Nannochloropsis sp. 4. Optimização das condições de operação para cada um dos métodos de extracção estudados.

3. Caparica, 4 de Novembro de 20093 Colheita de biomassa : 1. Coagulação-floculação; 2. Variação de pH; 3. Separação magnética; 4. Centrifugação; 5. Ultrafiltração; Extracção de óleos : 6. Bligh & Dyer; 7. Soxhlet; 8. Extracção com etanol com homogeneização prévia com esferas de vidro; 9. Extracção com etanol com aplicação prévia de ultrassons destrutivos. i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

4. Caparica, 4 de Novembro de 20094 1.Coagulação-floculação : 1.1. Agentes floculantes: FeCl 3.6H 2 O; FeSO 4.7H 2 O; Al 2 SO 4.18H 2 O; Ca(OH) 2 ; AlCl 3.6H 2 O e Lamas efluentes de um processo de anodização rica em alumínio com composição não passível de ser indicada. 1.2. Concentrações Utilizadas: 10, 25,50,100, 200 e 500 mg.l -1. i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

5. Caparica, 4 de Novembro de 20095 1.Coagulação-floculação : % Remoção entre 80% e 90% % Remoção superior a 90% Neochloris oleoabundans Concentração mg.l -1 FeCl 3 FeSO 4 Al 2 SO 4 Ca(OH) 2 AlCl 3 Lamas % Remoção 1063,12%36,92%81,20%63,77%81,34%- 2571,87%40,40%85,01%65,32%-- 5077,26%40,56%87,47%65,09%-- 10079,45%46,36%88,56%65,09%81,83%47,38% 20089,14%54,60%90,19%65,55%81,90%56,64% 50097,59%73,15%97,00%93,84%98,80%69,87% 1000-----85,37% Nannochloropsis sp. Concentração mg.l -1 FeCl 3 FeSO 4 Al 2 SO 4 Ca(OH) 2 AlCl 3 Lamas % Remoção 2529,42%42,18%65,36%2,28%-- 5039,39%60,66%83,39%2,83%39,39%- 10054,55%80,50%93,81%4,13%96,51%25,15% 20097,47%80,84%99,24%7,17%98,05%26,98% 50099,49%54,31%99,24%84,18%99,02%43,28% 1000 ----- 65,20% i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

6. Caparica, 4 de Novembro de 20096 2.Variação de pH : 2.1. Ácidos / Bases utilizados: Neochloris oleoabundans: HCl 1N e NaOH 1N; Nannochloropsis sp.: H 2 SO 4 1N e NaOH 1N. 2.2. Procedimento: Adição lenta de Ácido /Base com leitura permanente de pH; Indícios de formação de flocos  Interromper adição. Ácido Base Clarificado Concentrado i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

7. Caparica, 4 de Novembro de 20097 2.Variação de pH : % Remoção entre 80% e 90% % Remoção superior a 90% Nannochloropsis sp. Ácido- Base DO inicial pH inicial Temp. ºC Volume adicionado (ml) DO final pH final % remoção H 2 SO 4 1,989,2324,89 ml1,891,734,55 NaOH1,4849,2524,856 ml0,05712,1696,16 Neochloris oleoabundans Ácido- Base DO inicial pH inicial Temp. ºC Volume adicionado (ml) DO Final pH Final % remoção HCl0,6348,119,7200,5981,855,68 NaOH0,6348,119,790,6312,360,63 i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

8. Caparica, 4 de Novembro de 20098 3. Separação Magnética: 3.1. Reagentes Utilizados: Floculante: Al 2 SO 4.18H 2 0 (200 e 500 mg.l -1 ); Agente Magnético: Ferrite (500 e 1000 mg.l -1 ). 3.2. Instalação: Tubo: 1,7 m e 0,6 cm ɸ Magnetos volume: 19 cm 3 Entrada da cultura Saída da cultura i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

9. Caparica, 4 de Novembro de 20099 3. Separação Magnética: Neochloris oleoabundans DO InicialAl 2 SO 4 (mg.l -1 )Ferrite (mg.l -1 )DO final% Remoção 0,732005000,39845,48 0,70850010000,443,50 0,78220010000,39349,74 0,73500 0,48933,01 1,1122005000,80427,70* Nannochloropsis sp. DO inicialAl 2 SO 4 (mg.l -1 )Ferrite (mg.l -1 )DO final% Remoção 0,8962005000,75216,07 0,89650010000,78312,61 0,89620010000,55538,06 0,896500 0,76214,96 0,8962005000,79611,16* Floco (Ferrite + Alga) * Instalação reduzida i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

10. 10 4. e 5. Centrifugação e Ultrafiltração 4.1. Amostras de 300 ml; 4.2. 8500 rpm; 4.3. 5 minutos; 4.4. Beckman, Avanti J-25I. 5.1. Amostras de 3 Litros; 5.2. Queda de Pressão: 0,2 bar; 5.3. 1 hora de funcionamento; 5.4. Caudal Circuito: 510 litros por hora; 5.5. Mini Piloto Orelis; 5.6. Membrana acrílica Carbosep 300 kDalton (80 cm 2 ). i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

11. Caparica, 4 de Novembro de 200911 4. e 5. Centrifugação e Ultrafiltração Centrifugação Neochloris oleoabundansNannochloropsis sp. DO inicialDO final% de RemoçãoDO inicialDO final% de Remoção 0,6610,02895,761,2640,03597,23 0,8010,03395,881,2640,0397,63 Média:95,82Média:97,43 Ultrafiltração Microalga DO inicial DO clarificado % de Remoção Volume clarificado ml Caudal circuito (l.h -1 ) Caudal de atravessamento (l.h -1.m -2 ) Neochloris oleoabundans 1,5860,001~10064251080,25 Nannochloropsis sp. 1,5120,000~100575107,125 % Remoção entre 80% e 90% % Remoção superior a 90% i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

12. Caparica, 4 de Novembro de 200912 6. Bligh & Dyer (extracção com solvente a frio): 6.1. 100 mg alga liofilizada e uma solução de metanol, clorofórmio e água destilada – 80 (4*20) ml (10:5:4 v/v/v); 6.3. Acerto da solução metanol, clorofórmio e água destilada (10:5:4 v/v/v), na ampola de decantação (10:10:9 v/v/v); 6.4. Destilação do solvente em rotavapor. AgitaçãoCentrifugação Pipetar solvente para ampola de decantação e adicionar 20 ml de solvente 6.2. i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

13. Caparica, 4 de Novembro de 200913 6. Bligh & Dyer (extracção com solvente a frio): Neochloris oleoabundans Ensaio Massa Óleo (g) por 100 mg alga % Óleos 1.A.0,028728,63 a) 1.B.0,014714,72 a) 1.C.0,00737,36 1.D.0,00757,59 2.A.0,00636,31 2.B.0,00848,47 2.C.0,00666,61 2.D.0,00656,51 Média0,00717,14 Nannochloropsis sp. Ensaio Massa Óleo (g) por 100 mg alga % Óleos A0,016616,33858 B0,019619,14062 C0,020119,57157 D0,016316,05911 Média0,018117,78 a) Resultados desprezados i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

14. Caparica, 4 de Novembro de 200914 7. Soxhlet (extracção com solvente a quente): BalãoPré-Tratamento ASem Pré-tratamento B CMoagem com Areia D EUltrassons F 7.2. 2 g alga liofilizada e 125 ml de n-hexano; 7.3. 1.º e 2.º Ciclo: 4 horas 3.º Ciclo: 2 horas; 7.4. Ultrassons: 5 min a 150 s -1 Areia: Almofariz o mais fino possível; 7.5. Destilação do solvente em rotavapor. 7. 1. i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

15. 7. Soxhlet (extracção com solvente a quente): Neochloris oleoabundans BalãoPré-Tratamento Massa óleos (g) por 2 g de microalga seca % Óleos Rendimento % (Bligh & Dyer) ASem Pré-tratamento0,01400,70- BSem Pré-tratamento0,02441,22- Média--0,9613,47 CMoagem com Areia0,02601,30- DMoagem com Areia0,03331,66- Média--1,4820,80 EUltrassons0,01750,88- FUltrassons0,02341,17- Média--1,0314,37 Nannochloropsis sp. BalãoPré-Tratamento Massa óleos (g) por 2 g de microalga seca % Óleos Rendimento % (Bligh & Dyer) ASem Pré-tratamento0,12966,48- BSem Pré-tratamento0,11975,98- Média--6,2335,06 CMoagem com Areia0,252812,64- DMoagem com Areia0,235911,79- Média--12,2268,73 EUltrassons0,12826,41- FUltrassons0,14297,14- Média--6,7838,14 i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

16. Caparica, 4 de Novembro de 200916 8. e 9. Etanol – Homogeneização com esferas de vidro e Etanol – Ultrassons 8.1. 500 mg alga liofilizada, 1 g esferas de vidro, 40 ml etanol; 8.2. Homogeneizador (Heidolph, Diax 600), operação 10 min, 800 min -1 ; 8.3. Filtração da mistura; 8.4. Destilação do solvente em rotavapor. 9.1. 500 mg alga liofilizada, 40 ml etanol; 9.2. Ultrassons (B.Braun, Labsonic 2000), operação 5 min, 150 s -1 ; 9.3. Filtração da mistura; 9.4. Destilação do solvente em rotavapor. i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

17. Caparica, 4 de Novembro de 200917 8. e 9. Etanol – Homogeneização com esferas de vidro e Etanol – Ultrassons Etanol - Esferas de Vidro Neochloris oleoabundansNannochloropsis sp. Amostra Massa óleos (g) por 500 mg de alga % de ÓleosAmostra Massa óleos (g) por 500 mg de alga % de Óleos A0,01392,80A0,077315,49 B0,01162,28B0,092518,41 Média:2,54Média:16,95 Rendimento % (Bligh & Dyer)35,57 Rendimento % (Bligh & Dyer)95,34 Etanol - Ultrassons Neochloris oleoabundansNannochloropsis sp. Amostra Massa óleos (g) por 500 mg de alga % de ÓleosAmostra Massa óleos (g) por 500 mg de alga % de Óleos A0,01172,32A0,03867,70 B0,01392,72B0,061512,25 Média:2,52Média:9,97 Rendimento % (Bligh & Dyer)35,29Rendimento % (Bligh & Dyer)56,08 i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

18. Caparica, 4 de Novembro de 200918 1.Coagulação-floculação: os melhores floculantes são Al 2 SO 4 e AlCl 3 ; contém ião Al 3+ ; quantidades óptimas 200 e 500 mg.l -1. 2.Alteração pH: Nannochloropsis sp.; adição de 56 ml de NaOH; amostra de 500 ml. 3.Separação Magnética: % de remoção da biomassa para Neochloris oleoabundans (maior tamanho) na ordem dos 40- 50%, redução de custos na área utilizada. 4.Centrifugação: % de remoção de biomassa elevadas, processo oneroso considerando a produção de biodiesel a partir de microalgas. 5.Ultrafiltração: % de remoção de biomassa elevadas, caudal de atravessamento reduzido de 80,25 l.h -1. m -2 para a Neochloris oleoabundans e de 7,125 l.h -1.m -2 para a Nannochloropsis sp. Colheita da Biomassa i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

19. Caparica, 4 de Novembro de 200919 6.Bligh & Dyer: método com maior % de extracção de óleos (7,14% para a microalga Neochloris oleoabundans e 17,78% para a microalga Nannochloropsis sp.). Método de referência, Rendimento 100%. 7.Soxhlet: rendimentos entre 13,47 % (sem pré-tratamento) e 20,80 % (moagem com areia) para Neochloris oleoabundans e entre 35,06 % (sem pré-tratamento) e 68,73 % (moagem com areia) para Nannochloropsis sp. 8.Etanol - homogeneização com esferas de vidro: rendimento de 35,57% para Neochloris oleoabundans e 95,34% para a Nannochloropsis sp. 9.Etanol – ultrassons: rendimento de 35,29% para Neochloris oleoabundans e 56,08% para a Nannochloropsis sp. Extracção de Óleos i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

20. Caparica, 4 de Novembro de 200920 Os pré-tratamentos mecânicos testados no método de Soxhlet (moagem com areia e ultrassons), aumentam o rendimento de extracção, sendo o mais eficaz a moagem com areia. A fraca extracção do método de Soxhlet poderá ser devido ao solvente utilizado, n-hexano, que é um solvente com menor polaridade em comparação com o etanol ou o metanol. Os pré-tratamentos mecânicos que precederam a extracção com etanol (homogeneização com esferas de vidro e ultrassons), aumentaram o rendimento de extracção. Para a Neochloris oleoabundans foram igualmente eficazes, sendo que para a Nannochloropsis sp. a homogeneização com esferas de vidro foi o mais eficaz. Extracção de Óleos i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões

21. Caparica, 4 de Novembro de 200921 “As diferenças observadas nos rendimentos dos vários processos de extracção entre as duas microalgas (Neochloris oleoabundans e Nannochloropsis sp.) podem resultar de diferenças significativas na forma e tamanho celular, na estrutura da parede celular e nos lípidos das microalgas” Extracção de Óleos i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões Shen et al., 2009

22. i. Objectivo ii. Trabalho Desenvolvido iii. Metodologia iv. Resultados v. Conclusões vi. Agradecimentos Caparica, 4 de Novembro de 200922 Agradecimentos À Doutora Luísa Gouveia, pela orientação, acompanhamento e apoio. Ao Professor Doutor Nuno Lapa, pela orientação, encaminhamento e motivação. À Doutora Paula Passarinho e Doutora Paula Marques pelo apoio na execução dos ensaios realizados. À Dr.ª Ana Marques pelo apoio incansável nos ensaios realizados, pela companhia, e ensinamentos. À Doutora Ana Oliveira, Doutora Lourdes Bartolomeu e Doutora Isabel Paula pelo apoio na análise de resultados e disponibilização de dados e fotografias. Eng.º João Sousa e Eng.º Jorge Cunha pelo apoio nos ensaios realizados. À Sr.ª. Graça e Sr.ª. Natércia pelo apoio nos ensaios realizados e na produção das microalgas.