1. RA(4kb)- Atggagtccgaaatgctgcaatcgcctcttctgggcctgggggaggaagatgaggc……………………………………………….. ……………………………………………. ……………………….,……. …tactacatctccgtgtactcggtggagaagcgtgtcagatag RA- F(Hindlll) F 5’-CCC AAG CTT GG atg gag tcc gaa atg ctg caa tcg cct ctt -3’ (frame 땜에 추가 ) RA- R(Kpnl) R5’-GG GGT ACC cta tct gac acg ctt ctc cac cga gta cac -3’ RI(5.4kb)- atggcggcgatcggccgcggccgctctctgaagaacctccgagt………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………. aacaccaccaaagcaacctatagttgatacatctgctgaatcctga RA, RI gene full sequence and oligo Ri-F(Xho1) F5’-CCG CTC GAG CG atg gcg gcg atc ggc cgc ggc cgc tct ctg -3’ Ri R(Kpn1) R5’-GG GGT ACC tca gga ttc agc aga tgt atc aac tat agg -3’ Q1. 이 벡터와 subcloning 해요 올리고 디자인에 문제는 없는지요 ?

2. 4kb Ra (4kb) (5.4kb)Ri PCR agarose gel run Target size 는 맞지요 …… Cloning 이 안되어 pcr product 를 시퀀싱했더니 Ra,, RI 모두 각각 Match 했어요

3. PCR product sequencing 했더니 ------forward ->.good RA

4. CHERRY –RA(cloning 에 사용한 2 엔자임으로 잘랐음 4.7/4kb ) Cherry –rictor all self only vector 와 비교시 이밴드가 subclone 으로 보였으나 Sequencing 결과 no match…. Q2. 사이즈가 아닌가요 ??? Vector self Insert, vector 각각 2cut 해서 ligation 했고 콜로니도 다수 확보했어요.

5. Colony prep 해보면 모두 self …… 4.7kb ㅠㅠ CHERRY(4.7) +RI (5.4kb -930nt 쪽에 bamh1) RI-insert 의 930nt 에 BamH1 있어서 이엔자임으로 잘랐더니 2band 제생각엔 Q3. 사이즈가 얼추맞다고 생각했는데 아닌가요 ? sequencing 맞겨봤는데 ….. 다음슬라이드 참고 3kb 4.3kb 3 4 5 Vector cut -4.7kb CHERRY-RI 200 여개 확인

6. CTAGTCACATCAGTTGGAATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGT GGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGA CGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGAT CTCGAG ATGACCAGTGGTTTCT ACGGGATGCAGGC ATTCACACCCGCGCGCACCTGTTGCAGGCCATCTATGAAGGGGTGGTGT TCAGCCATATGACCCACCTCAACCGAATGCGCGAACGTTTTACTGATGTT CACACCCTACGCGTCACTGGCGGCCCGGCGCACTCCGATGTCTGGATG CAAATGCTGGCGG ACGTCAGCGGTCTGCGTATCGAGCTGCCGCAGGTGGAAGAAACCGGCT GCTTTGGTGCGGCCCTTGCCGCCCGCGTCGGCACCGGGGTTTATCACA ACTTCAGCGAAGCCCAACGTGACTTGCGACACCCGGTGCGCACCCTGCT GCCAGATATGACCGC CCATCAGCTTTACCAAAAAAAATATCAACGTTATCAGCATCTCATTGCCGC ACTTCAGGGCTTTCACGCCCGCATTAAGGAGCACACATTATGAGCCGAC CACTTCTGCAACTGGCCCTCGACCACTCATCACTTGAAGCCGCGCAGCG CGACGTGACGC TGTTAAAAGACAGCGTCGATATCGTCGAAGCGGGCACCATTCTCTGTTTA AACGAAGGGCTTGGCGCGGTGAAAGCCTTGCGCGAACAGTGCCCGGAC AAAATCATCGTTGCTGACTGGAAGGTCGCCGACGCTGGTGAAACGCTCG CGCAACAGGCGTT TGGCGCAGGCGCTAACTGGATGACCATCATCTGCGCCGCGCCGCTCGC GACGGTAGAAAAAGCCACGCAATGGCACAACGCTGCGGGGGTGAAATT CAGATAGAGCTGTTCGGTACTGGACGCTGGACGACGCCCGCGANTGGC ATCGTATTGGCGTGCGGCAGGCATTATCATCGCGNTCGTGATGCCAGGC ANCGGNCACATGGGCNAACNATTGNACGCATGANGCCTTTAAANTCGCC TNAGTTNNNTATGGGGATACCNTNTGACTGCNTNTTAAANTCCCGGAAAG TTNTGCGGGGGATGGAGGNGNANCGNCANGGTGGATTCTGCNACACNN TNGGGGGGGGNNATTATNGANTNAAACTGGAATTCNGGGGGGGGGAAA TGTTTTTTATTGGAAAAAATTNTTTGGCCAANTTGGNAAAAGGNTGNNTTC TNTTTTTNGGGGGAAAANNNNNNNNNNNAANANNNNNNNNN 시퀀싱 결과가 좋아 기대하고 alignment 해보니 오른쪽과 같 이 벡터의 MCS 만 MATCH 한 후 보라색 ATG ACC 이후는 과 연 어디서 온 것인지모를 INSERT…. Cherry-RI sequencing 결과.Cherry-Ri-F(Xho1) F5 ’ -CCG CTC GAG CG atg gcg gcg atc ggc cgc ggc cgc tct ctg -3 ’ Cherry-Ri-R(Kpn1) R5 ’ -GG GGT ACC tca gga ttc agc aga tgt atc aac tat agg -3 ’ xho1

7. Cherry+ra -10 번 clone V+2.3kb? GHERRY +ra- 13 번 clone V(4,7kb) +600bp? Only vector cut vector 도무지 클로닝이 안되고 계속 벡터셀프만 많았고 어렵사리 뭔가 ligation 된것들은 target 보다 작은 무언가가 Ligation 됩니다. 뭐가 문제인지 답답한데 조언부탁드려요. 두개의 clone 은 사이즈가 작은 것들이 나와요.