1. Spettroscopia UV-visibile (parte 1) Orbitali atomici Orbitali atomici Orbitali molecolari Orbitali molecolari Transizioni elettroniche Transizioni elettroniche Regole di selezione Regole di selezione Cromoforo Cromoforo Spettrofotometro Spettrofotometro Legge Lambert-Beer Legge Lambert-Beer

2. Spettroscopia UV-visibile La Spettroscopia Uv-visibile studia gli spettri di assorbimento di molecole nella regione compresa tra circa 200 e 700 nm.

3. Spettroscopia UV-visibile La Spettroscopia Uv-visibile studia gli spettri di assorbimento di molecole nella regione compresa tra circa 200 e 700 nm. Livello elettronico fondamentale Primo livello elettronico eccitato e-e-

4. Spettroscopia UV-visibile La Spettroscopia Uv-visibile studia gli spettri di assorbimento di molecole nella regione compresa tra circa 200 e 700 nm. Essendo coinvolti elettroni di legame, l’energia della radiazione assorbita può essere correlata con i tipi di legame presenti nella specie in esame. Livello elettronico fondamentale Primo livello elettronico eccitato Eccitazione assorbimento e-e- Le radiazioni della regione del visibile e dell'ultravioletto possiedono energia sufficiente a promuovere un salto degli elettroni nello stato fondamentale verso orbitali ad energia più alta in uno stato eccitato.

5. Che cosa succede dopo l’assorbimento di una radiazione UV-vis? Spettroscopia UV-visibile Livello elettronico fondamentale Primo livello elettronico eccitato e-e-

6. Lo stato eccitato ritorna allo stato elettronico fondamentale sia: per produzione di calore per emissione di una radiazione con energia uguale o minore a quella della radiazione assorbita *. * Quest’ultimo processo è noto con il nome di fluorescenza. Spettroscopia UV-visibile Livello elettronico fondamentale Primo livello elettronico eccitato e-e- Rilassamento emissione Che cosa succede dopo l’assorbimento di una radiazione UV-vis?

7. Spettroscopia UV-visibile HOMO LUMO e-e- Che cosa succede dopo l’assorbimento di una radiazione UV-vis? in un esperimento di assorbimento viene misurata l'eccitazione di un elettrone legato dall'Highest Occupied Molecular Orbital (HOMO) al Lowest Unoccupied Molecular Orbital (LUMO)

8. Regione dell’ultravioletto: copre una zona che comprende lunghezze d’onda che vanno da 200 a 400 nm fino a confinare con il violetto. Regione del visibile: la radiazione della luce visibile con compresa tra circa 400 e 700 nm, rappresenta una porzione molto piccola dello spettro elettromagnetico. All’interno di tale regione dello spettro ci sono tutti i colori che si vedono quando una luce bianca attraversa un prisma e che in ordine decrescente di lunghezza d’onda sono: rosso, arancione, giallo, verde, celeste, indaco, violetto. Spettroscopia UV-visibile

9. Orbitali molecolari Spettroscopia UV-visibile

10. Orbitali atomici Spettroscopia UV-visibile Il numero quantico principale n definisce il livello di energia dell'elettrone e la dimensione degli orbitali. Può assumere valori interi positivi: n = 1, 2, 3, 4, 5, 6 ……. Gli orbitali con lo stesso numenro quantico principale sono in totale n 2 e costituiscono un GUSCIO ???????? UN PO’ DI RIPASSO: Il numero quantico orbitalico l stablisce il numero dei sottolivelli in cui si differenzia ciascun livello. Ogni sottolivello raggruppa orbitali della stessa forma definita dal valore di l compreso tra 0 e (n – 1). Ogni sottolivello corrispondente a ciascun valore di l viene indicato con una lettera minuscola secondo il seguente schema: valore di l=0 1 2 3 4  simbolo s, p, d, f, g. Si parla quindi di orbitali di tipo s, orbitali di tipo p, orbitali di tipo d ecc. Il numero quantico magnetico (o orientazionale) m. Determina il numero di orbitali appartenenti a ciascun sottolivello e il loro orientamento nello spazio. Gli orbitali di uno stesso sottolivello sono isoenergetici (degeneri); m può assumere tutti i valori interi da -l a +l, compreso lo zero. Per esempio, per l = 1, m = -1, 0, +1, ossia al sottolivello p appartengono tre orbitali degeneri orientati secondo gli assi cartesiani: px, py, pz. Il numero quantico di spin, ms è associato al momento angolare di spin dell’elettrone e risulta indicativo del senso della rotazione, orario o antiorario, dell'elettrone attorno ad un proprio asse. Esso può assumere valore +1/2 e - 1/2. Ogni orbitale può contenere al massimo due elettroni (doppietto elettronico) con spin opposto.

11. Orbitali molecolari Spettroscopia UV-visibile

12. Schema energetico di formazione di OM partendo dagli OA dei due atomi A e B quando A e B sono omonucleari (stessi atomi). Il fatto che A e B siano due atomi uguali è dimostrato dallo stesso livello energetico per i 2s e i 2p dei due atomi. Orbitali molecolari Spettroscopia UV-visibile

13. Orbitali molecolari di tipo  Spettroscopia UV-visibile - sovrapposizione testa-a-testa – simmetria cilindrica della densità elettronica attorno all’asse internucleare.

14. Orbitali molecolari di tipo  Spettroscopia UV-visibile

15. Orbitali molecolari di tipo  Spettroscopia UV-visibile - sovrapposizione laterale – densità elettronica sopra e sotto l’asse internucleare

16. Schema energetico di formazione di OM partendo dagli OA dei due atomi A e B quando A e B sono omonucleari (stessi atomi). Il fatto che A e B siano due atomi uguali è dimostrato dallo stesso livello energetico per i 2s e i 2p dei due atomi. Molecola O 2 Orbitali molecolari O 2 Spettroscopia UV-visibile

17. Schema energetico di formazione di OM partendo dagli OA dei due atomi A e B quando A e B sono omonucleari (stessi atomi). Il fatto che A e B siano due atomi uguali è dimostrato dallo stesso livello energetico per i 2s e i 2p dei due atomi. Orbitali molecolari Spettroscopia UV-visibile Poiché la sovrapposizione per i p perpendicolari all'asse è minore che per quelli coassiali (perciò i legami conseguenti provocano una minore stabilizzazione), la  relativa a  * è minore che per  2 -  2

18. Schema energetico di formazione di OM partendo dagli OA dei due atomi A e B quando A e B sono eteronucleari. Il fatto che A e B siano due atomi uguali è dimostrato dallo stesso livello energetico per i 2s e i 2p dei due atomi. Orbitali molecolari NO Spettroscopia UV-visibile Poiché la sovrapposizione per i p perpendicolari all'asse è minore che per quelli coassiali (perciò i legami conseguenti provocano una minore stabilizzazione), la  relativa a  * è minore che per  2 -  2

19. Orbitali molecolari HF Spettroscopia UV-visibile le energie degli orbitali atomici caratterizzati dallo stesso numero quantico principale sono alquanto diverse nei due atomi. Questo comporta che non possono essere combinati gli orbitali atomici 1s dei due atomi e nemmeno quello 1s dell’idrogeno con quello 2s del fluoro. Da un punto di vista energetico risulta possibile solo la combinazione dell’orbitale atomico 1s dell’idrogeno con un dei tre orbitali 2p del fluoro in quanto la differenza di energia tra questi due tipi di orbitali non è molto grande

20. Orbitali molecolari HF Spettroscopia UV-visibile mentre è possibile la sovrapposizione dell’orbitale atomico 2p x dell’atomo di fluoro con quello 1s dell’idrogeno la cui simmetria è sferica, non è invece possibile la sovrapposizione di questo orbitale atomico con quelli 2p y e 2p z dell’atomo di fluoro.

21. Orbitali molecolari HF Spettroscopia UV-visibile Dalla combinazione dell’orbitale atomico 2p x del fluoro con quello 1s dell’idrogeno si formano due orbitali molecolari a simmetria sigma di cui uno legante σ 2px e l’altro antilegante σ* 2px mentre i due orbitali atomici 2p y e 2p z del fluoro contengono ciascuno una coppia di elettroni e, non essendo stati coinvolti nel legame, conservano la loro energia inalterata. Tali due orbitali atomici, tuttavia, pur conservando la stessa energia posseduta nell’atomo di fluoro isolato, in realtà appartengono alla molecola HF e vengono denominati orbitali molecolari non leganti.

22. Orbitali molecolari CO Spettroscopia UV-visibile Triplo legame: 1 , 2 

23. Orbitali molecolari Spettroscopia UV-visibile ordine di legame la metà della differenza tra il numero degli elettroni negli orbitali di legame e il numero degli elettroni negli orbitali di antilegame (gli elettroni negli eventuali orbitali molecolari di non legame non contribuiscono). OL = (ne - ne*)/2

24. Orbitali molecolari Spettroscopia UV-visibile

25. Orbitali molecolari e salti energetici Assorbimento quando  E=h Spettroscopia UV-visibile

26. In realtà, usare una radiazione con una frequenza utile a colmare il  non basta. Occorre che vengano verificate altre condizioni specifiche Regole di selezione I° regola di selezione La I° regola di selezione afferma che in una transizione elettronica si deve avere una forte ridistribuzione della carica elettrica e quindi una concreta variazione del momento dipolare. Passare da un orbitale molecolare all’altro vuol dire influenzare la distribuzione di cariche Questa distribuzione è dovuta al fatto che gli orbitali hanno geometrie diverse di densità elettronica (tra  e  * notiamo che la distribuzione delle cariche è diversa, lo stesso vale tra  e  ). Qual’è la transizione elettronica che non provoca una distribuzione delle cariche????? Per la verità non se ne riesce ad immaginare nemmeno una. Quindi la regola ci suggerisce che maggiore sarà la differenza di ridistribuzione, più probabile sarà la transizione maggiore sarà la differenza di ridistribuzione, più probabile sarà la transizione. Spettroscopia UV-visibile

27. Regole di selezione La II° regola di selezione ha a che vedere con lo “spin” elettronico: lo spin totale in una transizione si deve conservare Spettroscopia UV-visibile

28. Regole di selezione La II° regola di selezione ha a che vedere con lo “spin” elettronico: lo spin totale in una transizione si deve conservare Il numero di spin totale, chiamato S non è altro che: la sommatoria di tutti gli spin associati agli elettroni del nostro sistema: S =  si S= 0 ( tutti gli orbitali con coppie di elettroni) S= 1/2 oppure –1/2 (un solo elettrone spaiato); S= 1 (due orbitali con due elettroni spaiati) Spettroscopia UV-visibile

29. Regole di selezione La III° regola di selezione è detta regola della simmetria orbitalica. Essa afferma che una transizione è permessa solamente se la simmetria della distribuzione elettronica della  ² si conserva durante la transizione. Questa regola, in parole povere, ci dice che: Una transizione è tanto più probabile che avvenga quanto più la simmetria tra gli orbitali è conservata. OAOMcaratteristiche di simmetria rispetto all'asse di legame s  simmetria assiale; coassiale con l'asse di legame p  piano nodale contenente l'asse di legame d  due piani nodali perpendicolari intersecantesi lungo l'asse di legame Spettroscopia UV-visibile

30. Queste transizioni sono caratteristiche sia di composti organici sia di composti inorganici. Il gruppo di atomi in cui approssimativamente sono localizzati gli orbitali molecolari tra cui avviene la transizione viene chiamato cromoforo I cromofori più comuni sono caratterizzati da legami chimici multipli e sono detti perciò insaturi: tra essi il gruppo etilenico C=C, acetilenico C=C, carbonilico C=O. Cromoforo Spettroscopia UV-visibile

31. L’utilizzo dello spettro UV-Visibile per l’analisi qualitativa non può raggiungere i livelli di approfondimento consentiti da altre tecniche spettroscopiche quali IR a causa dello spettro stesso, che non appare quasi mai (specialmente per le soluzioni) sufficientemente dettagliato. Tuttavia può essere benissimo impiegato per una prima caratterizzazione della molecola, accontentandosi di ottenere da una simile tecnica solo la possibilità di operare magari una sommaria scelta fra varie alternative. Assorbimento dei composti organici Spettroscopia UV-visibile

32. Transizioni σ → σ* Queste transizioni sono quelle che richiedono le energie più elevate. Molecole come gli alcani saturi, che contengono solo legami C–C e C–H, danno solo questi assorbimenti, che cadono nella zona dell’UV lontano, detta anche UV sotto vuoto. Infatti in questa zona assorbe anche l’ossigeno dell’aria, per cui un’eventuale indagine andrebbe condotta eliminando tale interferenza, vale a dire operando sotto vuoto. Principali transizioni elettroniche Spettroscopia UV-visibile

33. Transizioni π → π* E’ tipica dei composti insaturi. Ne possiamo individuare tre tipi principali: transizione etilenica → banda tipica di sistemi π isolati transizione benzenoide → banda tipica del sistema benzenico; Transizione di coniugazione → è caratteristica di sistemi aromatici o comunque di doppi o tripli legami coniugati. Maggiore è la delocalizzazione, più alta è la lunghezza d’onda di assorbimento, ed aumenta anche la relativa intensità. Principali transizioni elettroniche Spettroscopia UV-visibile

34. Transizioni n → σ* e n → π* Queste bande sono del tipo R, cioè radicalico, perché interessano eteroatomi che dispongono di doppietti di non- legame e si trovano inseriti in un sistema π o in un sistema σ. È il caso di C=O, C=N, N=N, oppure il C–O, C–S, C–N (alcoli, mercaptani, ammine…) Principali transizioni elettroniche Spettroscopia UV-visibile

35. Transizioni per trasferimento di carica Sono di solito le più intense dello spettro, perché sono dovute a veri e propri spostamenti di elettroni da una parte all'altra della molecola. Transizioni d → d o f → f Nei composti di coordinazione, l'interazione del metallo centrale con i leganti ad esso coordinati provoca una separazione tra i cinque orbitali d (o i sette orbitali f, nel caso dei lantanidi), che in assenza dei leganti hanno tutti la stessa energia. Gli assorbimenti che corrispondono alle transizioni fra orbitali d (o f) cadono nella regione del visibile, perché i dislivelli sono relativamente piccoli, perciò i composti di coordinazione dei metalli di transizione e dei lantanidi appaiono spesso colorati. Gli spettri dei composti di coordinazione, dunque, mostrano le bande di assorbimento dei leganti insieme all'assorbimento caratteristico dei metalli di transizione (che hanno orbitali d) o dei lantanidi (che hanno orbitali f) e l'assorbimento per trasferimento di carica. Principali transizioni elettroniche Spettroscopia UV-visibile

36. Principali transizioni elettroniche Spettroscopia UV-visibile

37. Le transizioni osservabili per un gruppo carbonilico C=O sono illustrate schematicamente nel seguente grafico. Spettroscopia UV-visibile

38. In generale la complessità molecolare non influisce sulla complessità spettrale, pertanto è possibile individuare particolari raggruppamenti in molecole complesse, confrontando gli spettri con quelli di molecole più semplici. Spettro UV-visibile Spettroscopia UV-visibile

39. L’esame degli assorbimenti caratteristici dei vari gruppi funzionali ha dimostrato che non sono numerosi i casi nei quali lo spettro elettronico risulta effettivamente utile, come nel caso di dieni e trieni coniugati, aromatici, carbonili coniugati… Possiamo quindi stilare una serie di linee guida: ♥ Assorbimenti molto forti nell’intervallo 200–300 nm (ε: 10.000–20.000) indicano sistemi di almeno due cromofori coniugati, uguali o diversi. Se la banda è ancora più spostata verso il visibile, la coniugazione è certamente elevata. ♥ Assorbimenti piuttosto forti nella zona 270–370 nm (ε: 5.000–16.000); indicano sistemi aromatici con sostituenti polari, che danno luogo anche a bande di trasferimento di carica. Le bande si spostano vero il visibile quanto maggiore è la coniugazione, oppure quando sono presenti più sostituenti con elettroni mobili. ♥ Assorbimenti deboli o di media forza nell’intervallo 210 – 300 nm (ε: 200 – 8.000): indicano sistemi aromatici con sostituenti alchilici, ma anche transizioni n → σ* di atomi che possiedono doppietti di non legame Criteri di riconoscimento delle sostanze organiche Spettroscopia UV-visibile

40. ♥ Assorbimenti molto deboli nella zona 200 – 300 nm (ε: 10 – 100): indicano transizioni n → π* e caratterizzano i gruppi N=O, C=O, N=N, C=S… ♥ Assorbimenti analoghi ai precedenti ma nell’intervallo 400 – 1.500 nm (ε: 20 – 1.000) sono dovute a transizioni interne di tipo d → d o f → f dei metalli di transizione o dei lantanidi ♥ Assorbimenti molto forti (ε: 30.000 – 50.000) verso il visibile indicano bande di trasferimento di carica intermolecolari o intramolecolari. Criteri di riconoscimento delle sostanze organiche Spettroscopia UV-visibile

41. In definitiva si può dire che lo spettro UV diventa decisivo quando il dato che fornisce è in negativo. Ad esempio: L’assenza di assorbimento sopra i 180 nm esclude la presenza di sistemi aromatici o comunque coniugati L’assenza di assorbimento tra 230 – 280 nm esclude la presenza di anelli benzenici Criteri di riconoscimento delle sostanze organiche Spettroscopia UV-visibile

42. Spettrofotometro UV-visibile SpettrometroFotometro Produce luce di lunghezze d’onda selezionate (generalmente contiene un monocromatore) Misura l’intensità della radiazione Spettroscopia UV-visibile

43. Spettrofotometro a singolo raggio Video consigliato  https://www.youtube.com/embed/O39avevqndUhttps://www.youtube.com/embed/O39avevqndU Video consigliato  https://www.youtube.com/watch?v=pxC6F7bK8CU IL MONOCROMATORE è un PRISMA o un RETICOLO DI DIFFRAZIONE Converte l’Intensità della radiazione in Intensità di corrente 1) Si mette nella cuvetta il solvente e si misura l’Intensità. 2) Si lava la cuvetta. 3) Si mette la soluzione e si misura l’intensità. 4) Si fa il rapporto fra le due Intensità E’ sensibile a: temperatura, luce alla stessa misurazione del bianco che deve essere ripetuta per ogni misurazione Spettroscopia UV-visibile

44. Il bianco (o riferimento) è costituito dal solvente ad eccezione della sostanza di cui si vuol esaminare l’assorbimento La radiazione proveniente dal MONOCROMATORE si divide in due raggi che sono inviati contemporaneamente al campione ed al solvente. Il secondo raggio passa attraverso il campione e fuoriesce con l’Intensità trasmessa I campione Il computer registra entrambi i raggi in modo alterno e calcola il rapporto. Più complesso e costoso, ma consente una grande precisione e praticità anche nelle analisi quantitative, poiché registra il bianco una sola volta e poi continua in automatico Spettrofotometro a doppio raggio Spettroscopia UV-visibile

45. Legge Lambert-Beer Spettroscopia UV-visibile

46. T=I/I 0 Trasmittanza A=-logT=log(I 0 /I) Assorbanza c= concentrazione dell’analita (M) b= cammino ottico (cm) I 0 = intensità del raggio incidente I= intensità del raggio in uscita I0I0 I b A( )=  cb legge di Lambert-Beer Beer, Lambert e altri hanno dimostrato che T diminuisce in modo esponenziale in rapporto alla concentrazione c del composto colorato e alla lunghezza del percorso della luce, b, nel modo seguente: T= 10 -εcl Spettroscopia UV-visibile Legge Lambert-Beer (http://www.rsc.org/learn-chemistry/resource/res00001432/beers-law-simulation)

47. I0I0 I b A( )=  cb L’assorbanza quantifica l’assorbimento di fotoni di lunghezza d’onda da parte di analiti presenti nel campione Spettroscopia UV-visibile Legge Lambert-Beer

48. Per misure fatte con cuvette con differente cammino ottico, l’intensità trasmessa I diminuisce esponenzialmente con l’aumentare del cammino ottico I0I0 I b I b I0I0 Spettroscopia UV-visibile Legge Lambert-Beer A( )=  cb

49. In alternativa, nel caso di cuvette con cammino ottico costante, l’intensità trasmessa decresce esponenzialmente con l’aumentare della concentrazione del soluto ASSORBENTE I0I0 I b I c I0I0 Spettroscopia UV-visibile Legge Lambert-Beer A( )=  cb

50. Spettroscopia UV-visibile Legge Lambert-Beer CUVETTA In UV si utilizzano celle in quarzo (SiO 2 ), Nel visibile si utilizzano celle in vetro o quarzo o alcuni materiali plastici.

51. La grandezza  dipende da. Al fine di determinare la concentrazione di una specie attraverso la legge di Lambert-Beer, occorre che  sia costante. Ciò si realizza utilizzando radiazioni monocormatiche Spettroscopia UV-visibile Legge Lambert-Beer A( )=  cb

52. Nella spettroscopia UV-VIS il campione viene irraggiato con radiazioni UV e/o visibile. Le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata (se sono rispettate determinate condizioni). La risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole. Il tipo di interazione fornisce la risposta analitica: qualitativa  identificazione attraverso le assorbite quantitativa  legge di Lambert-Beer Riassumendo…………… Spettroscopia UV-visibile

53. A( )=  cb La legge di Lambert-Beer descrive BENE il comportamento in assorbimento di soluzioni tali che la concentrazione della sostanza in soluzione porti a valori di assorbanza inferiori a 1.5-2 (non più del 97-98% di I 0 deve essere assorbito). Orientativamente, per composti aventi valori di  di 1000, 10000 e 100000, la concentrazione minima di una sostanza che può essere determinata spettrofotometricamente è pari a 10 -3, 10 -4 e 10 -5 M rispettivamente.

54. Possibili deviazioni dalla legge di Lambert-Beer: 1.il campione si dissocia o associa in soluzione (deviazione chimica) 2.la radiazione non è monocromatica (deviazione strumentale) 3.si ha luce diffusa (deviazione strumentale) 4.il campione è fluorescente Spettroscopia UV-visibile A( )=  cb

55. Spettroscopia UV-visibile (parte 1) Che cosa è un orbitale atomico? Che cosa è un orbitale atomico? Che cosa è un orbitale molecolare? Che cosa è un orbitale molecolare? Quali sono le transizioni elettroniche molecolari permesse e perché? Quali sono le transizioni elettroniche molecolari permesse e perché? Che cosa si intende per cromoforo? Che cosa si intende per cromoforo? Quali sono gli elementi base di uno spettrofotometro? Quali sono gli elementi base di uno spettrofotometro? Che cosa è la legge di Lambert-Beer? Che cosa è la legge di Lambert-Beer? Quando si hanno deviazioni dalla legge di Lambert-Beer? Quando si hanno deviazioni dalla legge di Lambert-Beer?

56. Bande d’assorbimento A( )=  cb legge di Lambert-Beer Spettroscopia UV-visibile

57. Perché si misura l’assorbanza al picco di assorbimento? Spettroscopia UV-visibile Bande d’assorbimento

58. Spettroscopia UV-visibile Bande d’assorbimento Perché si misura l’assorbanza al picco di assorbimento?

59. Perche’ si osserva una banda d’assorbimento? Spettroscopia UV-visibile Bande d’assorbimento

60. Spettroscopia UV-visibile Bande d’assorbimento Perche’ si osserva una banda d’assorbimento?

61. Bande d’assorbimento Spettroscopia UV-visibile Perche’ si osserva una banda d’assorbimento?

62. In molte molecole organiche l’assorbimento della luce cade nel campo dell’ultravioletto (UV 150-380 nm) e tali sostanze sono quindi incolori (nei liquidi e nelle soluzioni) o bianche (allo stato solido). Molte altre assorbono nel visibile (c.a. 400-800 nm) e danno luogo a colorazioni intense. E’ il caso delle molecole riportate in Figura come il carotene (colore della carota e delle foglie d’autunno), la clorofilla (colore delle foglie verdi), il licopene (colore rosso dei pomodori) e di moltissime altre molecole. Spettroscopia UV-visibile

64. La clorofilla (di qualsiasi tipo) presenta colore verde-giallastro. Da un punto di vista fisico, questo vuol dire che la clorofilla assorbe tutto le lunghezze d’onda dello spettro tranne quelle in prossimità dei 490-590 nm.

65. Quando in una molecola sono presenti due o più cromofori in coniugazione diretta tra loro si assiste ad un marcato effetto batocromico quasi sempre accompagnato da un effetto da un effetto ipercromico attribuibile alla maggiore facilità della transizione elettronica. Effetto della coniugazione Spettroscopia UV-visibile

66. Effetto della coniugazione Spettroscopia UV-visibile

67. Effetto della coniugazione Spettroscopia UV-visibile

68. Effetto della coniugazione Ciò spiega l’esistenza di composti organici colorati, come il metilarancio, la fenolftaleina, la clorofilla, la caffeina o il  -carotene che presentano un massimo di assorbimento nel visibile. Tutti i composti citati presentano doppi legami coniugati ed è proprio l’estesa coniugazione che è responsabile dell’assorbimento nel visibile. Spettroscopia UV-visibile

69. Variazioni spettrali Spettroscopia UV-visibile le Max sono fortemente influenzate dal solvente: un solvente polare, solvatando la molecola, ne abbassa l’energia dello stato eccitato più di quanto non faccia per quello fondamentale. Così, per la transizione  →  * si ottiene un aumento della λ Max di 10 – 20 nm aumentando la polarità del solvente perchè questa transizione diventa più facile. le Max di alcuni cromofori sono fortemente sensibili all'intorno chimico e si spostano, a volte molto vistosamente. Entrambe le cause precedenti possono comportare spostamenti verso il visibile (RED SHIFT) o verso l'UV (BLUE SHIFT), a seconda che avvicinino o allontanino i livelli fondamentale e eccitato

70. Variazioni spettrali Spettroscopia UV-visibile le  sono analogamente molto influenzate dall'intorno chimico: si può avere aumento di intensità (ipercromia) o diminuzione (ipocromia); alcuni gruppi, che non assorbono di per sè stessi in modo molto intenso, danno luogo ad aumentate ed  se attaccati ad un cromoforo: sono gli auxocromi e contengono sempre un doppietto di non legame come -I, -Cl, -NR 2, -OH.

71. Spettroscopia UV-visibile Spettro UV dell’olio di oliva Gli acidi grassi polinsaturi sono facilmente ossidabili ed è possibile l'isomerizzazione da cis a trans e lo slittamento dei doppi legami dalla posizione isolata a quella coniugata. Gli idroperossidi cis e trans con doppi legami coniugati possono essere analizzati all'UV, dato che: i dieni assorbono ad una lunghezza d'onda di 232 nm i trieni a circa 270 nm. L’analisi del fenomeni di assorbimento UV permette di accertare rapidamente se l’olio è vergine, rettificato o miscelato con oli raffinati

72. Spettroscopia UV-visibile Spettro UV dell’olio di oliva dieni trieni I valori di assorbimento vengono espressi come assorbanza specifica (K) intendendo con questa espressione l'assorbanza ad una certa lunghezza d'onda, di una soluzione all'1 % dell'olio in esame nel solvente prescelto, osservata in una cuvetta dello spessore di 1cm. K = A / c *s K λ = estinzione specifica alla lunghezza d’onda λ A λ = valore dell'assorbanza misurata alla lunghezza d’onda λ c = concentrazione della soluzione espressa in g/100 ml. s = spessore della cuvetta di quarzo nella quale viene esaminata la soluzione dell'olio in esame.

73. Spettroscopia UV-visibile Spettro UV dell’olio di oliva dieni trieni Il regolamento (CE) N. 1989/2003 della commissione del 6 novembre 2003 ha stabilito per l’olio d’oliva i seguenti limiti:

74. Cromofori importanti in molecole biologiche Usi pratici della spettroscopia UV-vis Misura della concentrazione di acidi nucleici mediante A 260 Misura della concentrazione di proteine mediante A 280 Studio delle variazioni strutturali subite da molecole (ad esempio denaturazione) Spettroscopia UV-visibile

75. Cromofori nelle proteine Il legame peptidico (214 nm, lontano UV) Ponte disolfuro (250 nm) Anello aromatico (280 nm, vicino UV) Spettroscopia UV-visibile

76. Spettro Ultravioletto delle proteine La banda della fenilalanina è la meno intensa e si osserva a minori lunghezze d’onda. Il suo contributo è completamente oscurato da quello di tirosina e triptofano, quando sono presenti questi residui. Spettroscopia UV-visibile

77. Spettro Ultravioletto delle proteine Spettro di assorbimento di quattro proteine: La tripsina ha un alto contenuto in tirosina, l’ albumina ha un alto contenuto in fenilalanina, il chimotripsinogeno ha un alto contenuto in triptofano la gelatina (collagene) ha un basso contenuto in tutti e tre questi aminoacidi. Spettroscopia UV-visibile

78. Tipicamente per poter quantificare la concentrazione di una proteina viene usata la regione del vicino UV piuttosto che il lontano UV in quanto molti solventi assorbono o diffondono in questa ultima regione spettrale, pertanto interferendo con l’assorbimento del cromoforo amidico Gli amino acidi aromatici hanno un coefficiente di estinzione molare ben caratterizzato nell’intervallo 250-300 nm. Pertanto, se si conosce il numero di tirosine o triptofano nella proteina, si può calcolare un coefficiente di estinzione per la proteina ad una determinata lunghezza d’onda ed usare questo per misurare la concentrazione della proteina in soluzione  280 nm (tirosina) = 1280 cm -1 M -1  280 nm (triptofano)= 5690 cm -1 M -1 Spettro Ultravioletto delle proteine Spettroscopia UV-visibile

79. Il reale vantaggio di questo metodo per determinare la concentrazione delle proteina è che il campione non viene distrutto ed il metodo è molto rapido Una accurata misura della concentrazione della proteina prevede l’impiego di :  una curva di assorbimento standard prodotta con campioni di proteina pura a concentrazione nota  un bianco che contenga la stessa concentrazione di tampone e di sale del campione  una cuvetta di quarzo, in quanto contrariamente al vetro, non assorbe luce UV Spettro Ultravioletto delle proteine Spettroscopia UV-visibile

80. Nella figura è mostrato come lo spettro del polipeptide poli-L-lisina possa modificarsi per: l’effetto di un aumento di pH che induce la formazione dell’  -elica da una struttura a matassa l’effetto di un aumento di temperatura che converte il polipeptide in  -foglietto. L’assorbimento del gruppo peptidico a 190-200 nm è molto sensibile alla struttura secondaria di polipeptidi e proteine. Spettroscopia UV-visibile

81. Questo è un esempio di ipocromismo, particolarmente rilevante negli acidi nucleici, assieme al suo opposto di ipercromismo. Il fenomeno può essere usato nello studio dei processi di denaturazione e rinaturazione, sfruttando i diversi coefficienti di assorbimento, per determinare quantitativamente le frazioni di forma nativa e denaturata. L’assorbimento del gruppo peptidico a 190-200 nm è molto sensibile alla struttura secondaria di polipeptidi e proteine. Spettroscopia UV-visibile

82. Le basi presentano sistemi delocalizzati in anelli eterociclici, e le transizioni sono di tipo  -  *. Spettro Ultravioletto di Acidi Nucleici Il forte assorbimento nel vicino UV degli acidi nucleici è determinato quasi esclusivamente dalle basi pirimidiniche e puriniche. Infatti gli zuccheri e i gruppi fosfato hanno assorbimenti a < 150 nm.

83. Tutti gli spettri delle basi mostrano un forte assorbimento intorno a 260 nm. Spettro Ultravioletto di Acidi Nucleici

85. A (260) DNA doppio filamento 1.00 DNA singolo filamento1.37 Basi libere1.67 Ipocromicità/Ipercromicità nell’assorbimento degli ac. nucleici

86. In generale, gli acidi nucleici hanno un assorbimento inferiore alla somma delle assorbanze dei nucleotidi individuali Ipocromicità/Ipercromicità nell’assorbimento degli ac. nucleici

87. Questo effetto è molto utile per vedere se gli acidi nucleici sono strutturati A (260) DNA doppio filamento 1.00 DNA singolo filamento1.37 Basi libere1.67 Ipocromicità/Ipercromicità nell’assorbimento degli ac. nucleici

88. L’effetto ipercromico può essere spiegato in base alla configurazione elicoidale dei polimeri del nucleotide. In una struttura così regolarmente impacchettata i cromofori non possono essere considerati residui “isolati”, indipendenti gli uni dagli altri. Lo spostamento elettronico che ha luogo quando una base assorbe un quanto di energia è sentito anche dalle basi vicine in conseguenza alla modificazione del campo elettrico. Se l'interazione è forte, diventa impossibile parlare di un assorbimento "localizzato" in un residuo particolare. L’effetto ipercromico è causato anche dalla presenza di interazioni intermolecolari. Ipocromicità/Ipercromicità nell’assorbimento degli ac. nucleici

89. Una regola generale prevede che MODIFICAZIONI CONFIGURAZIONALI CHE NON CAMBIANO LA STRUTTURA ELETTRONICA NON MODIFICANO L’ASSORBIMENTO TOTALE Ipocromicità/Ipercromicità nell’assorbimento degli ac. nucleici