The ubiquitin-proteasome system and its role in the cell cycle

The cell cycle מחזור התא הוא רצף האירועים העוברים על התא מרגע שהוא נוצר ועד שהוא מתחלק לשני תאי בת. מחזור התא מתחלק לארבעה שלבים עיקריים וכל שלב מתקיים פעם אחת בלבד בכל מחזור. שלב S סינתזה של DNA, שלב M מיטוזה ובניהם שני שלבי ביניים G1 ו-G2 בהם מתרחשת בקרה של התא לגבי היכולת והמוכנות להמשיך במחזור. במהלך G1 התא מעריך את גודלו ואת התנאים הסביבתיים ורק אז נכנס לשלב הכפלת המטען הגנטי. במידה והתנאים אינם מספיקים התא נכנס לשלב המכונה G0 בו הגדילה והמטאבוליזם מינימליים, מצב זה יכול להמשך תקופות ארוכות. שלב G2 מאפשר זמן לבדיקה האם הכפלת ה-DNA תקינה וכן גדילה עד לחלוקה עצמה.

How is the cell cycle regulated? All events need to happen in the right order. Each event needs to happen once and only once! protein synthesis post-translational modifications התא מבקר את אירועי מחזור התא ע"י סינתזה של חלבונים, מודיפיקציה של חלבונים, כמו זרחון ופירוק חלבונים. פירוק הוא תהליך בלתי הפיך ולכן הוא מבטיח התקדמות חד-כיוונית: ברגע שכבר אין חלבון הנחוץ לקיום לשלב מסוים, התא ממשיך לשלב הבא פירוק חלבונים החיוניים לשלב מסויים היא הדרך הטובה ביותר להבטיח שכל שלב במחזור בתא יתקיים פעם אחת בלבד בכל מחזור. protein degradation

How are proteins degraded? by the ubiquitin-proteasome system פרוטאוליזה היא בקרה מרכזית באירועי מחזור התא. חלבונים רבים עוברים פירוק ע"י מערכת היוביקוויטין פרוטאוזום. חלבונים אלה מסומנים לפירוק ע"י הצמדה של שרשרת יוביקוויטין שמאפשרת לחלבון להיות מזוהה ע"י הפרוטאוזום. היוביקוויטין התגלה ותואר במחקר שהתבצע בסוף שנות ה-70 ע"י אברהם הרשקו ואהרון צ'חנובר מהטכניון יחד עם אירווין רוז מהמכון לחקר הסרטן בפילדלפיה. מחקר זה הביא לפריצת דרך בחקר הסרטן ובמחק מחלות נוספות ולכן זיכה את החוקרים בפרס נובל לכימיה בשנת 2004. Avram Hershko Aaron Ciechanover Irwin Rose Nobel prize in chemistry, 2004

What is ubiquitin? 76 amino acids polypeptide very highly conserved from plants to eukaryotes ubiquitous (= widely distributed) to all cells active in different cellular processes like DNA repair, cellular trafficking, endocytosis. היוביקוויטין הוא חלבון קטן בן 76 ח.א. שמור באבולוציה. היוביקוויטין מסמן חלבונים המשתתפים במגוון תהליכים תאיים בניהם תיקון נזקי DNA, trafficing ואנדוציטוזיס. אחד התפקידים החשובים של היוביקוויטין הוא סימון חלבונים לפירוק ע"י הפרוטאוזום. Its main role is in tagging proteins for degradation by poly-ubiquitin chains.

Tagging proteins with ubiquitin E1 - ubiquitin activating enzyme Non specific E2 - ubiquitin conjugating enzyme E3 - ubiquitin protein ligase Substrate specific Transfers the ubiquitin to a lysine residue of the substrate. פירוק תלוי יוביקוויטין מתבצע במספר שלבים: בשלב הראשון האינזים E1 משתמש ב-ATP כדי ליצור קשר בינו לבין חלבון היוביקוויטין בשלב השני היוביקוויטין המאוקטב מועבר לאתר הפעיל של האנזים E2 בסוף התהליך האנזים E2 מרכיב שרשרת יוביקוויטין על חלבון המטרה בעזרת הליגאז E3. בתא קיים E1 אחד ומספר בודד של אנזימי E2. הספציפיות לסובסטרט מתקבלת ע"י אנזימי E3 השונים הקיימים בתא זאת גם הסיבה שהיוביקוויטין ליגאזות נמצאים תחת בקרה הדוקה בתא. Synthesis of a polyubiquitin chain on the substrate by conjugation of additional ubiquitin molecules through lysine 48. E4

The poly-ubiquitin chain 1 2 U5 U4 U3 U2 U1 1 - poly-ubiquitinated protein 2- poly-ubiquitinated protein incubated with de-ubiquitinating enzyme

The proteasome A 20S barrel-like core with proteolytic activity Two 19S regulatory subunits responsible for ubiquitin chain recognition, removal of ubiquitin and protein unfolding. הפרוטאוזום מצוי בציטופלסמת התא והוא בעל מבנה המזכיר חבית חלולה. הפרוטאוזום מורכב משני חלקים: איזור פנימי חלול בעל פעילות פרוטאוליטית ושתי תת יחידות רגולטוריות האחראיות לזיהוי שרשרת היוביקוויטין, הסרת חלבוני היוביקוויטין ופתיחת קיפול החלבון. יחד, כל היחידות מכונות 26S proteosome. The whole proteasome (core+regulatory units) is often referred to as the 26S proteasome.

Degradation in the protasome חלבון זה מזוהה ומפורק ע"י הפרוטאוזום לפפטידים קצרים בעוד שחלבוני היוביקוויטין ממוחזרים לשימוש חוזר בתא. The poly-ubiquitinated protein is recognised by the 26S proteasome, unfolded and degraded. The ubiquitin molecules are recycled.

APC/C - the mitotic E3 APC/C =Anaphase Promoting Complex/ Cyclosome 1500 KDa Multi-subunit complex (~12 subunits). Known to be active from metaphase through G1. Regulates chromatide separation and exit from mitosis. ה-APC/C הוא היוביקוויטין ליגאז שמבצע יוביקוויטינציה לחלבוני מטרה בשלבי המיטוזה ו-G1. יוביקוויטין ליגאז זה בודד ואופין במקביל ע"י שתי קבוצות. הקבוצה של הרשקו מהטכניון כינתה אותו ציקלוזום, כדי להדגים את האקטיבציה והאינאקטיבציה המעגליים של פירוק הציקלין. הקבוצה של קירשנר מהרווארד כינתה אותו APC= Anaphase Promoting Complex כדי להדגיש את תפקידו החיוני לתחילת האנפאזה. ה-APC/C הוא קומפלקס גדול הבנוי מכ-12 תת יחידות והוא פעיל משלב המטפאזה ועד סוף G1. הקומפלקס מסמן לפירוק ציקלינים מיטוטיים וחלבוני מטרה נוספים הנחוצים ליציאה ממיטוזה והפרדת כרומטידות אחיות

Oscillation patterns of two APC/C substrates Cells were synchronised in mitosis (M) with nocodazole. They were released into fresh medium and samples were taken every two hours. Housekeeping gene substrate 1 substrate 2 M G1 G1/S S G2 פרוטאוליזה של חלבונים היא מנגנון בקרה מרכזי השולט בהנעת מחזור התא. מנגנון זה מבקר אירועים רבים לפני ובמהלך המיטוזה. הפרוטאוליזה היא ספציפית ומאפשרת פירוק של חלבוני מטרה מסוימים בשלב מדויק של מחזור התא, היא מהירה ובלתי הפיכה ולכן מובילה לשינוי מהיר וחד כיווני של מצב התא. נסתכל על דוגמא שתמחיש לנו עד כמה הפירוק הוא ספציפי ותלוי שלב במחזור התא: הניסוי התבצע על תאים פיברובלסטים של עכבר. התאים סונכרנו ע"י Noc אשר מונע את הווצרות סיבי הקישור ולכן גורם לתאים להעצר בשלב הפרומטפאזה (תחילת המיטוזה). עיכוב זה הוא הפיך ולכן שחרור התאים למדיום טרי מאפשר להם להמשיך כרגיל במחזור התא. בחלק התחתון של הג'ל ניתן לראות את דגם הביטוי של Actin שהוא housekeeping gene ואינו מושפע ממחזור התא. הוא משמש כביקורת להטענה. שני החלבונים שמעליו מראים דגם ביטוי משתנה לאורך מחזור התא: CycB הוא חלבון חשוב שמבקר יחד עם CDK1 אירועים רבים החשובים עבור כניסה למיטוזה, אולם יש צורך בפירוקו כדי שהתא יוכל לצאת ממיטוזה. ואכן ניתן לראות כי רמת החלבון גבוה ב-M החלבון לא קיים בשלב G1 (לאחר היציאה ממיטוזה). החלבון מסונתז שוב בסוף שלב S ומצטבר עבור פעילות מחודשת כדי להכנס למיטוזה של המחזור הבא. דוגמא נוספת היא של החלבון Cdh1. חלבון זה נקשר ל-APC/C ומאפשר את פעילות מתחילת G1 ועד הכניסה לשלב S. בשלב M החלבון קיים בתא אך לא פעיל מכיוון שהוא מזורחן. זרחון זה מונע ממנו להקשר ל-APC/C. בסוף המיטוזה חלה דה-פוספורילציה של החלבון, הוא פעיל ונקשר ל-APC ויחד הם מסמנים לפירוק חלבונים תאיים שפירוקם נחוץ עבור ההשארות בשלב G1. גם כאן ניתן לראות פירוק של Cdh1 שמשתנה לאורך שלבי מחזור התא השונים. * Cdh1 מסמן את עצמו לפירוק ולכן דווקא ב-G1 בוא הוא פעיל רמתו נמוכה (הקומפלקס APC/C- Cdh1 מסמן לפירוק את Cdh1 החופשי בתא

Some roles of ubiquitin-mediated protein degradation control of cell division signal transduction regulation of gene expression immune response embryonic development apoptosis ראינו שפירוק חלבונים ע"י מערכת היוביקוויטין פרוטאוזום חיונית עבור קיום מחזור תא תקין בו כל שלב מתקיים פעם אחת בלבד אבל מערכת זו מבקרת מספר רב של תהליכים בתא וחלבונים רבים מסומנים לפירוק בעזרת מערכת זו. בין התהליכים ניתן למצוא מסלולי העברת סיגנל, בקרה על ביטוי גנים, התפתחות ואפופטוזיס. לכן לא מפתיע שנמצאו הקשרים רבים בין שיבושים שונים במערכת זו לבין מחלות שונות ביהן סרטן, מחלות לב וכלי דם ומחלות נוירודגנרטיביות.