Antibiogram By:Dr. S. S. Khoramrooz In the name of God Department Of Microbiology Yasouj University of Medical Sciences Antibiogram By:Dr. S. S. Khoramrooz Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Yasuj University of Medical Sciences, Yasuj, Iran

آنتی بیوگرام بررسی تعیین حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک های مورد استفاده و شناسایی مقاومت در باکتریها عدم نیاز به بررسی حساسیت در بعضی باکتریها استرپتوکوکوس پایوژنز انجام تست در باکتریهایی که ژنهای مقاومت را کسب میکنند انتروباکتریاسه سودوموناس استافیلوکوکوس انتروکوکوس استرپتوکوکوس پنومونیه 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

آنتی بیوگرام آنتی بیوگرام: تعیین حساسیت یا مقاومت میکروبها نسبت به مواد ضد میکروبی در آزمایشگاه روشهای مختلف: Broth-Macrodilution (tube-Dilution) Tests Broth-Microdilution Tests Agar-Dilution Tests E-test Disk Agar Diffusion 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

Broth-Microdilution Tests 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

Broth-Microdilution Tests A broth microdilution susceptibility panel containing 98 reagent wells and a disposable tray inoculator. A broth microdilution susceptibility panel containing 98 reagent wells and a disposable tray inoculator Reller L B et al. Clin Infect Dis. 2009;49:1749-1755 © 2009 by the Infectious Diseases Society of America

Antimicrobial susceptibility testing using micro-broth dilutions ug/ml 64 32 16 8 4 2 • 96 well microtiter plate

Minimal Bactericide Concentration MIC The lowest concentration of antibiotic that prevented growth represented the Minimal Inhibitory Concentration. MBC Minimal Bactericide Concentration 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

E- test 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

E- test A Staphylococcus aureus isolate tested by the Etest gradient diffusion method with vancomycin (VA), daptomycin (DM), and linezolid (LZ) on Mueller-Hinton agar. A Staphylococcus aureus isolate tested by the Etest gradient diffusion method with vancomycin (VA), daptomycin (DM), and linezolid (LZ) on Mueller-Hinton agar. The minimum inhibitory concentration of each agent is determined by the intersection of the organism growth with the strip as measured using the scale inscribed on the strip. Reller L B et al. Clin Infect Dis. 2009;49:1749-1755 © 2009 by the Infectious Diseases Society of America

روش دیسک آگار دیفیوژن Disk Agar Diffusion تهیه سوسپانسیون میکروبی خالص برابر با کدورت استاندارد مک فارلند استفاده از سواب جهت انتقال سوسپانسیون به محیط کشت مولر هینتون و پخش آن در سطح محیط کشت قرار دادن دیسک های حاوی آنتی بیوتیک در سطح محیط کشت انکوباسیون در دمای مناسب بررسی نتایج و تفسیر 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

تهيه كدورت استاندارد نيم مك فارلند 1- هدف: جهت استاندارد کردن غلظت تلقيح براي آزمايش تعيين حساسيت ميكروبي، استفاده از استاندارد سولفات باريم (BaSo4)، برابر با استاندارد نيم مک فارلند 2- مواد و ابزار لازم: کلرور باريم دهيدراته، اسيدسولفوريک، مزور، بالن ژوژه، لوله آزمايش در پيچ دار استريل

3- روش انجام کار: استاندارد نيم مک فارلند سولفات باريم به روش زير تهيه مي شود : 0/5 میلی لیتر از کلرور باريم ((BaCl2) mol/l 0/048 ) (2H2O . W/VBaCl21/175% 5/ 99 میلی لیتر اسيد سولفوريکmol/l 0/18 (V/V 1%) اضافه کنيد و با هم زدن مداوم سوسپانسيون بدست آوريد. 2) چگالي صحيح کدورت استاندارد با استفاده از اندازه گيري جذب در اسپکترو فتومتر با طول مسیر نوري cm1، مشخص شود. جذب در nm625 بايد بين 0/08 تا 0/13 باشد.

3) سوسپانسيون سولفات باريم بايد به مقدار ml6-4 در لوله هاي در پيچ دار هم اندازه با لوله هاي سوسپانسيون باکتريايي ريخته شود. 4) درب اين لوله ها بايد محکم بسته شوند و نگهداری در دماي اتاق و در تاريکي . 5) همزدن استاندارد سولفات باريم قبل از هر بار استفاده به شدت (ترجيحا با ورتکس مکانيکی)، جهت ايجاد کدورت يکنواخت. در صورت مشاهده ذرات بزرگ، بايد استاندارد تازه اي تهيه گردد. 6) استاندارد سولفات باريم بايد به صورت ماهانه جايگزين شود يا جذب آن اندازه گيري گردد.

Dr. S. S. Khoramrooz

Antimicrobial discs Stocks of antimicrobial discs should preferably be kept at -20 ∞C A small working supply of discs can be kept in the refrigerator for up to 1 month Turbidity standard 0.6 ml of a 1% (10 g/l) solution of barium chloride dihydrate into a 100-ml graduated cylinder, filling to 100ml with 1% (10 ml/l) sulfuric acid. The turbidity standard solution should be placed in a tube identical to the one used for the broth sample. It can be stored in the dark at room temperature for 6 months. 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

روش دیسک آگار دیفیوژن Susceptibility Testing Methods Incubate plate 18-24 hr, 35 C Measure and record zone of inhibition around each disk Innoculate MH plate Place disks on agar plate

Disk Diffusion Susceptibility Testing Mueller Hinton agar & good disk placement Improper agar & disk placement Use Mueller Hinton agar

اندازه گیری قطر منطقه تعیین حساسیت اندازه گیری قطر منطقه تعیین حساسیت اندازه گیری قطر هاله عدم رشد حساس (Sensitive; S) نیمه حساس (Intermediate; I) مقاوم (Resistant; R) 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

12/2/2018 S. S. Khoramrooz

12/2/2018 S. S. Khoramrooz

12/2/2018 S. S. Khoramrooz

Antimicrobial discs Stocks of antimicrobial discs should preferably be kept at -20 ∞C A small working supply of discs can be kept in the refrigerator for up to 1 month Turbidity standard 0.6 ml of a 1% (10 g/l) solution of barium chloride dihydrate into a 100-ml graduated cylinder, filling to 100ml with 1% (10 ml/l) sulfuric acid. The turbidity standard solution should be placed in a tube identical to the one used for the broth sample. It can be stored in the dark at room temperature for 6 months. 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

12/2/2018 S. S. Khoramrooz

Quality control These tests should preferably Standard procedure for quality control Standard strains for quality control These tests should preferably be run every week, or with every fifth batch of tests, and, in addition, every time a new batch of Mueller–Hinton agar or a new batch of discs is used. 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

Preparing the inoculum The cultures may be inoculated into any type of broth, and incubated until the broth is turbid. Each broth should be streaked onto an agar plate and incubated overnight. Single colonies should then be picked off and submitted to susceptibility tests. Placing antimicrobial discs After the inoculum has been streaked on to the plates, the appropriate discs should be applied. The discs to be selected for each control strain . 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

Reading the plates After 16–18 hours incubation, the diameters of the inhibition zones should be measured with a ruler and recorded, together with the date of the test, on a special quality control chart. When the results consistently fall outside the acceptable limits, action Grossly aberrant results, which cannot be explained by technical errors in the procedure, may indicate contamination or sudden changes in the susceptibility or growth characteristics of the control strain. If this occurs, a fresh stock strain should be obtained from a reliable source.hould be taken to improve the quality of the test. 12/2/2018 S. S. Khoramrooz

کنترل کيفيت ديسک هاي آنتي بيوتيک جهت انجام آزمايش تعيين حساسيت ميکروبي به روش disk diffusion agar Dr. S. S. Khoramrooz

هدف از برنامه کنترل کيفي پايش و ارزيابي موارد زير مي باشد: هدف از برنامه کنترل کيفي پايش و ارزيابي موارد زير مي باشد: صحت و دقت روش انجام آزمايش تعيين حساسيت مواد و وسايل به کار برده شده در اين آزمايش عملکرد افرادي که آزمايش را انجام داده و نتايج بدست آمده را قرائت مي نمايند. به منظور دست يابي بهينه به اين اهداف در دسترس داشتن سويه هاي کنترل کيفي تهيه شده از مراکز معتبر ضروري است. Dr. S. S. Khoramrooz

سويه هاي کنترل کيفي پيشنهادي توسطCLSI عبارتند از: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 35218 Haemophilus influenzae ATCC 49247 Haemophilus influenzae ATCC 49766 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Dr. S. S. Khoramrooz

E.coli ATCC 35218 فقط به عنوان يک ميکروارگانيسم کنترلي براي ترکيبات ممانعت کننده بتالاکتاماز، مثل ترکيبات حاوي کلاولانيک اسيد، سولباکتام يا تازوباکتام پيشنهاد مي شود. Enterococcus faecalis ATCC 29212 (يا E.faecalis ATCC 33186) براي ارزيابي محيط مولر هينتون آگار با ديسک تري متوپريم/ سولفامتوکسازول استفاده مي شود. درمحيط کشت قابل قبول، هاله عدم رشد واضحي به قطر mm 20 يا بزرگتر ايجاد مي شود در حاليكه در محيطهاي کشت غير قابل قبول، هاله عدم رشد ايجاد نمي شود يا در داخل هاله، رشد کم مشاهده مي شود و يا هاله اي با قطر کمتر از mm 20 ايجاد ميگردد. اين کار به منظور بررسي مقادير غيرقابل قبول تيميدين در محيط کشت مزبور است. Dr. S. S. Khoramrooz

Enterococcus faecalis ATCC 29212 همچنين براي کنترل ديسکهاي آمينو گليکوزيد با دوز بالا به کار مي رود. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 به عنوان يک سويه کنترلی براي آزمايشات ESBL به کار برده مي شود. Dr. S. S. Khoramrooz

کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي سويه هاي کنترل کيفي را بايد به روش استاندارد آزمايش disk diffusionو با استفاده از همان مواد و روشي که براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي کلينيکي استفاده مي شود آزمايش و نتايج را با جداول 3 و A3 CLSI ( ضميمه 3) مقايسه و بررسي نمود. محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول براي هر سويه کنترلي نسبت به يک ديسک آنتي بيوتيکي در جداول فوق فهرست شده است. Dr. S. S. Khoramrooz

در اين صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهيه شود. چنانچه تغيير در ميانگين قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا در روش انجام آزمايش نباشد، احتمالا" ناشي از تغيير در حساسيت ذاتي باکتري نسبت به آن آنتي بيوتيک مي باشد. در اين صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهيه شود. Dr. S. S. Khoramrooz

آزمايش کنترل کيفيت را بايد درچه فواصل زماني انجام داد؟ آزمايش کنترل کيفيت را بايد درچه فواصل زماني انجام داد؟ الف _ انجام آزمايش روزانه براي هر سويه کنترلي با يک ديسک آنتي بيوتيکي بايد 20 روز متوالي آزمايش تعيين حساسيت انجام و نتايج با مقادير قابل قبول اشاره شده در جداول فوق مقايسه گردد. بر اساس ضريب اطمينان 95% تنها يک مورد از 20 نتيجه قرائت شده مي تواند خارج از محدوده كنترل باشد (به ضميمه 2مراجعه کنيد). چنانچه بيشتر از يک مورد خارج از محدوده کنترل باشد نياز به اقدامات اصلاحي خواهد بود، که در ادامه توضيح داده مي شود. Dr. S. S. Khoramrooz

ب _ انجام آزمايش هفتگي - در صورتيكه تنها يک مورد از 20 نتيجه قطر هاله عدم رشد براي هر سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي خارج از محدوده قابل قبول مندرج در جداول 3 وA 3 ( ضميمه 3) قرار گيرد ، کنترل کيفي روزانه را به هفتگي تغيير دهيد (به ضميمه 2 مراجعه کنيد). - آزمايش کنترل کيفي هفتگي را يکبار در هفته و هم چنين زمانيکه يکي از عوامل آزمايش (مانند سري ساخت آگار يا ديسکهای تهيه شده از يک سازنده) تغيير کند، انجام دهيد. اگر هر يک از نتايج کنترل کيفي هفتگي خارج از محدوده قابل قبول باشد، انجام اقدامات اصلاحي مورد نياز است . Dr. S. S. Khoramrooz

اقدامات اصلاحي (Corrective actions) الف نتايج خارج از محدوده قابل قبول به دليل خطاهاي مشهود و واضح شامل: استفاده از ديسک اشتباه استفاده از سويه کنترلی اشتباه آلودگي واضح سويه استفاده غيرعمدی از دما و شرايط اشتباه انکوباسيون بوجود آمده است . دراين حال بايد دليل ايجاد خطا مکتوب و پس از اصلاح آزمايش دوباره تکرار شود . اگر نتايج گزارش شده در محدوده مورد نظر قرار گرفت ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد . Dr. S. S. Khoramrooz

ب _ عامل ايجاد نتايج خارج از محدوده کنترل نامشخص است ب _ عامل ايجاد نتايج خارج از محدوده کنترل نامشخص است. در اين حال بايد اقدامات اصلاحي فوري بشرح زير انجام شود. آزمايش را جهت يک سويه کنترلي / ديسک آنتي بيوتيکي براي 5 روز متوالي تکرار و همه نتايج را ثبت کنيد. اگر اندازه هر 5 قطرهاله مطابق جداول 3 و A3 ( ضميمه 3) و در محدوده قابل قبول باشد ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد. اگر اندازه هر يک از 5 قطر هاله عدم رشد خارج از محدوده قابل قبول باشد ، به عمليات اصلاحي اضافي نياز است. آزمايشهاي کنترلي روزانه بايد ادامه داده شود تا به دليل نهايي مشکل پي برده شود. Dr. S. S. Khoramrooz

اندازه گيري و ثبت صحيح قطر هاله هاي عدم رشد عمليات اصلاحي اضافي: وقتي عمليات اصلاحي فوري مشکل را حل نکرد، احتمالا" خطاي مشاهده شده بعلت بروز يك اشکال کلي در سيستم و نه يک خطاي تصادفي ايجاد شده است. در اين حالت بايد موارد بيشتري بررسي شوند. مانند: اندازه گيري و ثبت صحيح قطر هاله هاي عدم رشد رعايت تاريخ انقضا و شرايط نگهداري ديسکها و مواد مورد استفاده (دور از رطوبت و در دماي مناسب) Dr. S. S. Khoramrooz

مناسب بودن دما و اتمسفر انکوباتور تغييرنيافتن يا آلوده نبودن سويه هاي کنترل مطابقت صحيح سوسپانسيون تلقيح با استاندارد نيم مک فارلند استفاده از پليت کشت تازه برای تلقيح (پليت کشت بايد تازه بوده و مدت زمان انكوباسيون آن بيشتر از 24 ساعت نباشد) وقتي مشکل بر طرف شد، می‌توان کنترل کيفي هفتگي را برقرار کرد. Dr. S. S. Khoramrooz

نگهداري ديسکهاي آنتي بيوتيکي - ديسکها بايد در يخچال˚C 8 و پايين تر ، يا در فريزر˚C 14- و پايين تر تا زمان مصرف نگهداري شوند. - تمامي ديسکهاي گروه بتالاکتام مانند پني سيلين، آمپي سيلين، کربني سيلين، تيکارسيلين، اگزاسيلين و نسل اول، دوم و سوم سفالوسپورين ها و ... بايد در فريزر نگهداري شوند، و فقط مي توان مقداري از آن را بر اساس کار روزانه آزمايشگاه حداکثر به مدت يک هفته در يخچال نگهداري نمود. - بعضي آنتي بيوتيکهاي حساس مثل ايميپنم ، سفاکلر و ترکيبات کلاولانيک اسيد يا سولباکتام اگر تا هنگام مصرف در فريزر نگهداري شوند، پايداري بيشتري خواهند داشت. - ديسکها بايد در ظروف داراي درپوش محکم و حاوي مواد جاذب رطوبت نگهداري شوند. - ديسکهای آنتي بيوتيکي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از يخچال يا فريزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند. Dr. S. S. Khoramrooz

Detection Strategy: step 1 Screen Enterobacteriaceae with : Cefpodoxime- best general ESBL substrate Cefotaxime & ceftazidime- good substrates for CTX-M & TEM/SHV, respectively Dr.T.V.Rao MD

Combination disk method Carter MW et al: J Clin Microbiol 2000; 38: 4228 - 4232 Difference > 5 mm Dr.T.V.Rao MD

ESBL Confirmatory Test Positive for ESBL Cefotax/CA Ceftaz/CA Ceftaz Cefotax 43 Dr.T.V.Rao MD jhindler nltn MW tele #2 2005

روش شناسایی استافیلوکوکوس مقاوم به متی سیلین مولر هینتون همراه با 2% نمک دیسک اگزاسیلین 1 میکروگرمی Dr. S. S. Khoramrooz

پايان Dr. S. S. Khoramrooz