Institut für Laboratoriumsmedizin, Klinische Chemie und Molekulare Diagnostik Bestimmung von Steroidhormonen in Serum mit LC-MS/MS- von der Methodenentwicklung bis zur Routinetauglichkeit von der Methodenentwicklung bis zur Routinetauglichkeit Linda Kortz 6. LC-MS/MS Anwendertreffen Tutzing

Zielstellung meiner Arbeit - simultane Bestimmung von klinisch relevanten Steroidhormonen aus Serum - schnelle, robuste Methode mit integrierter Probenvorbereitung - LC-MS/MS Setup sollte für andere Anwendungen adaptierbar sein (z.B. Immunsuppressiva) Einleitung

Analytisches Target: Steroidhormone OH HO OH H HH Estriol O O HO OH O HH H O OH O OH H HH O HO H HH O O S O O HO H HH O O H HH O OH H HH O OH O OH HO H HH OH HO H HH 11-Deoxycortisol DHEAS Androstendion DHEA Cortisol Testosteron Aldosteron β-Estradiol Androgene Mineralcorticoid Estrogene Glucocorticoid HO HH H HO O H HH HO OH O H HH O OH O HH H O O H HH Progesteron 17-OH-Pregnenolon 17-OH-Progesteron Cholesterol Pregnenolon Einleitung

Immunoassay vs. LC-MS/MS Immunoassay ist die Routinemethode für die klinisch- chem. Diagnostik von Steroidhormonen, aber für jeden Analyt ist ein eigener Assay erforderlich.... oft mangelt es an Spezifität. Einleitung

Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle Gliederung

Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle -Lösungsmittelqualität Gliederung

Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle -Lösungsmittelqualität -Deuterierte Standards Gliederung

Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle -Lösungsmittelqualität -Deuterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle HPLC Gliederung

LC-MS/MS von Steroidhormonen Geräte-Konfiguration HPLC: Shimadzu Prominence MS/MS: 4000 QTrap Gerätekonfiguration

Q1 Spektrum von 17-OHP [M+H] + [M+H-H 2 O] m/z, amu 1.0e6 5.0e6 9.0e6 Intensität, cps APCI - Steroidspezifische Bildung von M+H + und M+H-H 2 O + Spezies, zusätzl. M-H - Ionisierung Steroide bilden M+H + / M+H-H 2 O + Molekülionen Bsp.: 17-OHP

Q1 Spektrum von 17-OHP [M+H] + [M+H-H 2 O] m/z, amu 1.0e6 5.0e6 9.0e6 Intensität, cps APCI - Steroidspezifische Bildung von M+H + und M+H-H 2 O + Spezies, zusätzl. M-H - - charakteristische Fragmente: m/z 97 bzw. 109 Ionisierung Steroide bilden M+H + / M+H-H 2 O + Molekülionen Bsp.: 17-OHP

Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? ESIAPCIAPPI Spezies S/N EstradiolM+H-H 2 O DHEAM+H-H 2 O DHEASM+H-H 2 SO AndrostendionM+H TestosteronM+H ProgesteronM+H OHPM+H DeoxycortisolM+H AldosteronM+H CortisolM+H EstradiolM-H AldosteronM-H Standard-Mix c= 1 ng/mL (30 µL Injektion auf Trennsäule) Ionisierung

Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? ESIAPCIAPPI Spezies S/N EstradiolM+H-H 2 O DHEAM+H-H 2 O DHEASM+H-H 2 SO AndrostendionM+H TestosteronM+H ProgesteronM+H OHPM+H DeoxycortisolM+H AldosteronM+H CortisolM+H EstradiolM-H AldosteronM-H Standard-Mix c= 1 ng/mL (30 µL Injektion auf Trennsäule) Ionisierung

Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? ESIAPCIAPPI Spezies S/N EstradiolM+H-H 2 O DHEAM+H-H 2 O DHEASM+H-H 2 SO AndrostendionM+H TestosteronM+H ProgesteronM+H OHPM+H DeoxycortisolM+H AldosteronM+H CortisolM+H EstradiolM-H AldosteronM-H Standard-Mix c= 1 ng/mL (30 µL Injektion auf Trennsäule) Ionisierung

Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? APCI ist guter Kompromiss! ESIAPCIAPPI Spezies S/N EstradiolM+H-H 2 O DHEAM+H-H 2 O DHEASM+H-H 2 SO AndrostendionM+H TestosteronM+H ProgesteronM+H OHPM+H DeoxycortisolM+H AldosteronM+H CortisolM+H EstradiolM-H AldosteronM-H Standard-Mix c= 1 ng/mL (30 µL Injektion auf Trennsäule) Ionisierung

Aspekte der LC-MS/MS- Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle  -Lösungsmittelqualität -Deuterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle HPLC Gliederung

Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! APCI, injiziert wurden 40 µL 10 Mix 1 ng/mL auf die Trennsäule 0.00E E E E E E E+05 Estradiol Cortisol Androstendion 11-Deoxycortisol Testosteron 17-OHP DHEA DHEAS Aldosteron Progesteron Signalflächen gradient grade A Lösungsmittel MeOH

Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! APCI, injiziert wurden 40 µL 10 Mix 1 ng/mL auf die Trennsäule 0.00E E E E E E E+05 Estradiol Cortisol Androstendion 11-Deoxycortisol Testosteron 17-OHP DHEA DHEAS Aldosteron Progesteron Signalflächen gradient grade B gradient grade A Lösungsmittel MeOH

Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! APCI, injiziert wurden 40 µL 10 Mix 1 ng/mL auf die Trennsäule 0.00E E E E E E E+05 Estradiol Cortisol Androstendion 11-Deoxycortisol Testosteron 17-OHP DHEA DHEAS Aldosteron Progesteron Signalflächen LC-MS B LC-MS A gradient grade B gradient grade A Lösungsmittel MeOH

Aspekte der LC-MS/MS- Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle  -Lösungsmittelqualität  -Deuterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle HPLC Gliederung

Deuterierte Standards zeigen H/D- Austausch Q1 APCI, 550 °C, 1.5 mL/min MeOH/H 2 O 50/50 (v/v) O O D D D D D DD [M+H] + Androstendion-d7 [M+H] + Androstendion Deuterierte Standards

Deuterierte Standards zeigen H/D- Austausch Q1 APCI, 550 °C, 1.5 mL/min MeOH/H 2 O 50/50 (v/v) Q1 ESI, Raumtemperatur 10 µL/min MeOH/H2O 50/50 (v/v) O O D D D D D DD [M+H] + Androstendion-d7 [M+H] + Androstendion Deuterierte Standards

Stabile deuterierte Standards Deuterierte Standards Cortisol-d4 Estradiol-d3 Testosteron-d3 Androstendion-d7

Aspekte der LC-MS/MS- Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle  -Lösungsmittelqualität  -Deuterierte Standards  - Probenvorbereitung und schnelle HPLC Gliederung

Monolithische Trennsäule ermöglicht schnelle HPLC bei normalem Druck APCI positiv HPLC

Limitierung: gleichzeitige Quantifizierung von DHEAS und DHEA in Realproben [µg/L] DHEAS DHEA 0,1 -12,5 Referenzbereiche Serum (ILM) HPLC

Limitierung: gleichzeitige Quantifizierung von DHEAS und DHEA in Realproben [µg/L] DHEAS DHEA 0,1 -12,5 Referenzbereiche Serum (ILM) O HO H HH O O S O O HO H HH DHEAS DHEA M+H-H 2 SO 4 + m/z 271 M+H-H 2 O + m/z 271 Intensivster MRM: 271/213 HPLC

Limitierung: gleichzeitige Quantifizierung von DHEAS und DHEA in Realproben [µg/L] DHEAS DHEA 0,1 -12,5 Referenzbereiche Serum (ILM) - Weniger intensiver MRM für DHEAS nötig, da am Sättigungsbereich des Detektors - DHEA kann in Patientenproben von DHEAS-Signal überlagert werden O HO H HH O O S O O HO H HH DHEAS DHEA Entscheidung für klinisch relevantes DHEAS M+H-H 2 SO 4 + m/z 271 M+H-H 2 O + m/z 271 Intensivster MRM: 271/213 HPLC

Einfache und automatisierte Probenvorbereitung 1. Proteinfällung mit MeOH/ZnSO 4 Probenvorbereitung

Einfache und automatisierte Probenvorbereitung 1. Proteinfällung mit MeOH/ZnSO 4 2. On-line SPE Injektion Elution Autosampler Isokratische Pumpe Abfall Binäre Pumpe MS/MS Trennsäule SPE-Vorsäule Probenvorbereitung

Intensitäti x 10 5, cps Poros Intensität x 10 5, cps Cyclone Zeit, min Intensität x 10 5, cps Oasis HLB Poros R1, mm, 4000 Å, Applied Biosystems Cyclone, mm, 100 Å Cohesive Technologies Oasis HLB, mm, 80 Å, Waters SPE-Säulen -Vergleich - Desorptionsprofile Probenvorbereitung

On-line SPE-LC-MS/MS für Steroidhormone Zeit, min Intensität x 10 5, cps APCI positiv DHEAS Estriol Cortisol Aldosteron Androstendion β-Estradiol Testosteron 17-OH-Progesteron Progesteron Pregnenolon 11-Deoxycortiosol 17-OH-Pregnenolon DHEA Zeit, min Intensität x 10 5, cps 1.8 APCI negativ Aldosteron Estriol β-Estradiol Clin Chem Acta submitted on-line SPE-LC-MS/MS

Zusammenfassung -Die APCI ist für die Ionisierung bei der Messung eines Steroidprofils ein geeigneter Kompromiss. -Die Lösungsmittelqualität spielt eine nicht zu unterschätzende Rolle für die Ionisierung. -Der Bedarf für unter Quellenbedingungen stabilen deuterierten Standards ist gegeben. - Die Kombination aus on-line SPE und chromatographischer Trennung auf einer monolithischen Säule ermöglicht eine schnelle und effiziente Analytik mit einer Methodenlaufzeit von 4 min ausgehend von 100 µL Serum.

Ausblick -Für die Routineanalytik fehlen noch kommerziell erhältliche Kalibratoren und Kontrollen für LC-MS/MS. -Die Methode lief bisher in Batch-Ansätzen. Noch offen ist, wie die Methode über den Zeitraum von einem Jahr läuft, sowie die Adaptierbarkeit anderer Applikationen. -Die on-line SPE-LC-MS/MS für Steroidhormone wird zukünftig in Leipzig für Routinemessungen eingesetzt.

Danksagung ILM Leipzig Dr. Uta Ceglarek Dipl.-Chem. Sven Baumann Babette Niescher Dr. Martin Fiedler Prof. Dr. Jürgen Kratzsch Prof. Dr. Joachim Thiery Institut für Analytische Chemie, Uni Leipzig Prof. Dr. Stefan Berger Applied Biosystems Dr. Jan Lembcke, Dr. Roland Geyer