1. Summer Research
清華大學
生命科學系04級
孫敏瑜
891645

2. Introduction
2002年暑假我來到位於高雄的國立中山大學-卓忠隆老師的分子生物實驗室。卓老師讓我跟著他的得意門生-陳錦苡學長做一些簡單的分生實驗，以練習基本技術為主。錦苡學長的研究主題是:利用抑制性扣減雜交(Suppressor Subtractive hybridization，SSH)找出調控大鼠腦幹死亡過程的基因。
學長利用SSH建構了相關基因的cDNA library。而我所要做的就是將這些gene cloned，確定insert是正接或反接，然後送定序，可供後續研究用。
我總共cloned了兩個gene: GMF-β及s100。
原料:網狀腹外側核（rostral ventrolateral medulla（RVLM ))cDNA

3. 實驗過程
(1)以RVLM的cDNA ，加入欲clone gene的primer(f&r)， 再加入Taq polymerase ，run PCR。
(2)Run electrophoresis，check有產物。
(3)使用kit來purify PCR product。
(4)以分光光度計來測量DNA的濃度及純度。
(5)Run electrophoresis，與marker對照確定是我要的DNA片段。
(6)將這些純化的產物保存在-200C 冰箱。

4. 實驗過程
(7)接下來要準備transformation了， 所以我要自己製作agar plate(with amp & w/o amp) 還有自己製作competent cell (來源: e.coli JM-109) 。
(8)   Ligation: 將純化的PCR產物與本實驗所用的pGEM T easy vector進行ligation 。
(9)Transformation
(10)從plate上挑菌 (藍白篩選法)挑白色菌，種到含有LB medium的試管中，培養16-20hr。
(11)隔日，抽plasmid ，以EcoR I切3hr，再以electrophoresis確定是否有成功insert。

5. 實驗過程 (12)成功insert的那幾管菌，再重新培養到新的試管中。
(13)以kit 抽plasmid ，此時抽出的plasmid較純， 送定序check是正接or反接。
(14)本來想利用insert上的restriction enzyme切位與vector上的切位，使用適當的restriction enzyme來切， 可判斷是正接或反接。但上網查了一下GMF-B及s100上的切位，發現所需要的enzyme實驗室沒有。所以還是送定序來確定是正接或反接(因為兩者的序列可在網上查到) 。

6. 實驗流程

7. 實驗結果
1. GMF-β
(1)   PCR產物由電泳圖來看量還算夠

8. 實驗結果
(2)   Transformation效率不高， 可能是我做的competent cell效率不夠強， 或是ligation效果不夠好 。
(3)   restriction enzyme切割結果:

9. 實驗結果 大部分都有成功insert ， 我從這些成功的insert中挑了四管，再純化plasmid 。 (4)送定序
(5)定序結果:四個recombined plasmid都是正接的

10. 定序圖

11. 實驗結果
2. s100
(1)   PCR產物由電泳圖來看量還算夠

12. 實驗結果
(2)Transformation效率不高， 可能是我做的competent cell效率不夠強， 或是ligation效果不夠好。
(3)restriction enzyme切割結果:

13. 實驗結果
相當奇怪!!切出的片段有的不一樣長，只好將plasmid再做一次PCR ，確定有insert到正確片段(學長教的) 。

14. 實驗結果
由圖看no.3是錯的， no.1有兩條band也怪怪的，所以只有 比較有可能成功。學長說no.1的情形可能是最初PCR時，溫度沒有設好，所以primer不專一的接到別的片段，所以純化時也連這些片段一起純化。
ligation後產生兩種recombined DNA ，使transformation後有兩種菌產生:含有S100 及另一種insert的菌。為了確定，我又重挑了四管菌:no9-12 。

15. 實驗結果
抽plasmid切割後，與之前的no.2切割片段及plasmid PCR產物比較，發現竟然不一樣長…可見果然有insert到錯誤的DNA片段

16. 實驗結果
因為後來純化plasmid的kit沒了， 而且暑假也結束了， 所以來不及將s100送定序 --交給其他學長姐完成 。

17. 感想 這是我第一次進入實驗室做實驗，覺得非常新鮮又滿 興奮的。想到那些課本上描述的神奇實驗，如今我可
以親自動手操作，就覺得很有成就感。這一次我的重
心是放在基本操作的練習上，一整個暑假幾乎就是反
覆的PCR.抽plasmid.電泳…. 。以後等我學習了生化、
分生，更有基礎之後，我很期待可以開始真正的研究。