1. Сравнительная геномика – окончание М.Гельфанд «Сравнительная геномика и системная биология» БиБи, 4 курс + ШБ, 2 год + ПФУ весна 2013

2. Сохранение регуляции на больших эволюционных расстояниях Genome 2 Genome 1 Set of known sites PWM Genome N

3. Two major roles of zinc in bacteria Structural role in DNA polymerases, primases, ribosomal proteins, etc. Catalytic role in metal proteases and other enzymes

4. Genomes and regulators nZUR FUR family ??? AdcR ? MarR family pZUR FUR family

5. Regulators and motifs nZUR-  nZUR-  AdcRpZUR TTAACYRGTTAA GATATGTTATAACATATC GAAATGTTATANTATAACATTTC GTAATGTAATAACATTAC TAAATCGTAATNATTACGATTTA

6. Transporters Orthologs of the AdcABC and YciC transport systems Paralogs of the components of the AdcABC and YciC transport systems Candidate transporters with previously unknown specificity

7. zinT: regulation zinT is isolated fusion: adcA-zinT E. coli, S. typhi, K. pneumoniaeGamma-proteobacteria Alpha-proteobacteria B. subtilis, S. aureus S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogenes, L. lactis, E. faecalis Bacillus group Streptococcus group zinT is regulated by zinc repressors (nZUR- , nZUR- , pZUR) adcA-zinT is regulated by zinc repressors (pZUR, AdcR) (ex. L.l.) A. tumefaciens, R. sphaeroides

8. ZinT: protein sequence analysis E. coli, S. typhi, K. pneumoniae, A. tumefaciens, R. sphaeroides, B. subtilis L. lactis Y. pestis, V. cholerae, B. halodurans TMZnAdcA S. aureus, E. faecalis, S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogenes ZinT

9. ZinT: summary zinT is sometimes fused to the gene of a zinc transporter adcA zinT is expressed only in zinc-deplete conditions (regulated by zinc repressors) ZinT is attached to cell surface (has a TM-segment) ZinT has a zinc-binding domain ZinT: conclusions ZinT is a new type of zinc-binding component of zinc ABC transporter

10. Zinc regulation of PHT (pneumococcal histidine triad) proteins of Streptococcus spp. S. pneumoniae S. equi S. agalactiae lmbphtDphtE phtBphtA lmbphtD S. pyogenes phtY lmbphtD zinc regulation shown in experiment

11. Structural features of PHP proteins PHT proteins contain multiple HxxHxH motifs PHT proteins of S. pneumoniae are paralogs (65-95% id) Sec-dependent hydrophobic leader sequences are present at the N- termini of PHT proteins Localization of PHT proteins from S. pneumoniae on bacterial cell surface has been confirmed by flow cytometry

12. PHH proteins: summary PHT proteins are induced in zinc- deplete conditions PHT proteins are localized at the cell surface PHT proteins have zinc-binding motifs A hypothesis: PHT proteins represent a new family of zinc transporters

13. … incorrect  Zinc-binding domains in zinc transporters: EEEHEEHDHGEHEHSH HSHEEHGHEEDDHDHSH EEHGHEEDDHHHHHDED DEHGEGHEEEHGHEH (histidine-aspartate- glutamate-rich) Histidine triads in streptococci: HGDHYHY 7 out of 21 HGDHYHF 2 out of 21 HGNHYHF 2 out of 21 HYDHYHN 2 out of 21 HMTHSHW 2 out of 21 (specific pattern of histidines and aromatic amino acids)

14. Analyis of PHP proteins (cont’d) The phtD gene forms a candidate operon with the lmb gene in all Streptococcus species –Lmb: an adhesin involved in laminin binding, adherence and internalization of streptococci into epithelial cells PhtY of S. pyogenes: –phtY regulated by AdcR –PhtY consists of 3 domains: PHTinternalinH-rich 4 HIS TRIADS LRR IR HDYNHNHTYEDEEGH AHEHRDKDDHDHEHED

15. PHH proteins: summary-2 PHT proteins are induced in zinc-deplete conditions PHT proteins are localized at the cell surface PHT proteins have structural zinc-binding motifs phtD forms a candidate operon with an adhesin gene PhtY contains an internalin domain responsible for the streptococcal invasion Hypothesis PHT proteins are adhesins involved in the attachment of streptococci to epithelium cells, leading to invasion Current state Pht proteins are required for inhibition of complement deposition on the pneumococcal surface through the recruitment of complement factor H (Oqunniyi et al., 2009) Pht proteins may play a role in immune evasion, but the mechanism of function is unlikely to be mediated by factor H binding (Melin et al., 2010)

16. Zinc and (paralogs of) ribosomal proteins L36L33L31S14 E. coli, S.typhi –– – +– + – K. pneumoniae –– – –– – – Y. pestis, V. cholerae – –  – – +– + – B subtilis – – + –– + –– +– + – +– + S. aureus – – – –– – – – – +– + Listeria spp. – – –– – – – +– + E. faecalis – –  – ––  – – – – + –– + – S. pne., S. mutans – – – –– – – –– S. pyo., L. lactis – – – –– – – – – +– + nZUR pZUR AdcR

17. Zn-ribbon motif (Makarova-Ponomarev-Koonin, 2001) L36L33L31S14 E. coli, S.typhi (–)(–) – ( – ) + – K. pneumoniae (–)(–) – ( – ) – – Y. pestis, V. cholerae ( – )  – ( – ) + – B subtilis (–)(–)( – ) + – ( – ) + S. aureus (–)(–)( – ) – – – ( – ) + Listeria spp. (–)(–)( – ) – – ( – ) + E. faecalis (–)(–) ( – )  – – – ( – ) + – S. pne., S. mutans (–)(–)( – ) – – – (–)(–) S. pyo., L. lactis (–)(–)( – ) – – – ( – ) + nZUR pZUR AdcR

18. Summary of observations: Makarova-Ponomarev-Koonin, 2001: –L36, L33, L31, S14 are the only ribosomal proteins duplicated in more than one species –L36, L33, L31, S14 are four out of seven ribosomal proteins that contain the zinc-ribbon motif (four cysteines) –Out of two (or more) copies of the L36, L33, L31, S14 proteins, one usually contains zinc-ribbon, while the other has eliminated it Among genes encoding paralogs of ribosomal proteins, there is (almost) always one gene regulated by a zinc repressor, and the corresponding protein never has a zinc ribbon motif

19. Bad scenario Zn-rich conditions Zn-deplete conditions: all Zn utilized by the ribosomes, no Zn for Zn-dependent enzymes

20. Regulatory mechanism ribosomes Zn-dependent enzymes R Sufficient Zn Zn starvation R repressor

21. Good scenario Zn-rich conditions Zn-deplete conditions: some ribosomes without Zn, some Zn left for the enzymes

22. Prediction … (Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Aug 19;100(17):9912-7.) … and confirmation (Mol Microbiol. 2004 Apr;52(1):273-83.) Later: L31 is a depot; S14 and L33 are “failsafe” substitutes (integrity of ribosomes unde zink starvation). Owen et al, 2007: Of seven Zn- ribbon proteins, six are regulated in Streptomycs (also L28, L32, S18)

23. Метаболический путь синтеза рибофлавина (витамин В2)

24. Консервативная последовательность перед генами рибофлавинового пути из очень разных бактерий

25. Консервативная вторичная структура RFN-элемента Capitals: invariant (absolutely conserved) positions. Lower case letters: strongly conserved positions. Dashes and stars: obligatory and facultative base pairs N: any nucleotide. X: any nucleotide or deletion

26. RFN: механизм регуляции Transcription attenuation Translation attenuation

27. … и еще перед одним геном (ypaA) цветные стрелки – гены пути желтые стрелки – ypaA, ген с неизвестной функцией черные стрелки – регуляторный элемент

28. YpaA/RibU: транспортёр рибофлавина 5 предсказанных ТМ-сегментов => потенциальный транспортёр регуляторный RFN-элемент => ко- регуляция с генами метаболизма рибофлавина => транспорт рибофлавина или предшественника S. pyogenes, E. faecalis, Listeria: есть ypaA, нет генов биосинтеза рибофлавина => транспорт рибофлавина Предсказание: YpaA – рибофлавиновый транспортёр (Gelfand et al., 1999) Проверка: генетический анализ ( Кренева и др., 2000) биохимический эксперимент ( Burgess et al., 2006)

29. Биотиновый транспортер BioY

30. Метаболическая реконструкция пути биосинтеза тиамина (витамин В1) = thiN (confirmed) (Gram-positive bacteria) (Gram-negative bacteria) Transport of HMP Transport of HET

31. yuaJ(=thiT) тиаминовый транспортер (возможно, H + - зависимый) в фирмикутах 6 предсказанных трансмембранных сегментов Почти всегда регулируется THI-рибопереключателями Встречается в геномах, в которых отсутствует тиаминовый путь (Streptococcus spp.); В B. cereus импорт тиамина сопряжен с током протонов (Arch. Microbiol., 1977)

32. Почти всегда регулируются THI-рибопереключателями Не встречаются в геномах, в которых отсутствует тиаминовый путь Всегда встречаются вместе с thiD и thiE В ряде геномов (Pasteurellacee, Brucella некоторые фирмикуты) встречаются в отсутствие thiC thiX-thiY-thiZ и ykoF-ykoE- ykoD-ykoC: предсказанные АТФ-зависимые транспортеры HMP

33. Co и Ni ко-локализация (хромосомные локусы) –транспортеры Ni – с генами никель- зависимых ферментов –транспортеры Co – с генами синтеза кобаламина ко-регуляция –транспортеры Ni – фактор транскрипции NikR –транспортеры Co – рибопереключатель В12

34. Дмитрий Родионов  Thomas Eitinger

35. Пять семейств транспортеров

36. Новое семейство транспортеров Co и Ni

37. Структура локусов B12-элементсайт связывания NikRгены

38. Проверка: тест на транспорт ионов Co Ni

39. Структура: слишком много компонентов

40. Биотиновый транспортер BioY АТФаза BioM ~ CbiO = NikO Пермеаза BioN ~ CbioQ = NikQ

41. Для транспорта достаточно компонент МN (первый пример такого АВС-транспортера) cbiMNQO cbiMNQ cbiMN cbiM контроль

42. BioY тоже достаточно (даже в геномах, содержащих BioMN); у BioMNY более крутая кинетика

43. Верхушка айсберга?

47. Экспериментальные подтверждения RibU: рибофлавинThiT: тиамин FolT: фолат (ср. BioY)

48. Универ- сальный «энергети- ческий комплекс» + компоненты, определя- ющие специфич- ность

49. P Zhang et al. Nature 000, 1-4 (2010) doi:10.1038/nature09488 The overall structure of RibU.

50. NAD Metabolism: from E. coli to… Nicotinate Nicotinamide NA Ribose Transporter (pnuC) Nicotinamide Amidohydrolase (pncA) Nicotinamide Phospho- ribosyl transferase (pncB) Aspartate Oxidase (nadB) Quinolinate Synthase (nadA) Nicotinamide Ribose Kinase (nadR) Imino-Asp Nm Ribose Asp NaMN Adenylyl Transferase (nadD) NAD Synthase (nadE) NAD Kinase NMN Adenylyl Transferase (nadR) Quinolinate Phospho- ribosyl Transferase (nadC) NADNaAD NADP Quinolinate NMN NaMN  Universal and essential enzyme  Missing gene  Predicted by chromosomal clustering  Experimentally verified

51. NAD Metabolism: …Man Nicotinamide phospho- ribosyl transferase 5 Step Aerobic Pathway Trp Niacin Nicotinate Nicotinamide Nm Ribose Transporter (?) Nicotinamide Amidohydrolase (pncA) Nicotinamide Phospho- ribosyl transferase (pncB) Aspartate Oxidase (nadB) Quinolinate Synthase (nadA) Nicotinamide Ribose Kinase (?) Imino-Asp Nm Ribose Asp NaMN Adenylyl Transferase (hsPNAT) NAD Synthase NAD Kinase NMN Adenylyl Transferase (hsPNAT) Quinolinate Phospho- ribosyl Transferase NADNaAD NADP Quinolinate NMN NaMN Found in three newly sequenced bacteria Found in H.ducrei  Dual specificity (NaMN and NMN)  Missing gene  Projected from bacterial NadD  Activates a cancer drug