1. به نام خدا

2. Laboratory Investigation of Infectious gastroenteritis
Dr f.Hajmanoochehri
93/3

3. Clinical impression
2nd leading cause of death Infectious diarrhoea is the most common cause of diarrhoea Nosocomial diarrhea: patients, personnel usually a self limiting condition/ only some require diagnostic studies
4-6 میلیون مرگ در سال در کودکان
اهمیت عفونت در کشورهای توسعه نیافته بیشتر است
48 میلیون مورد عفونت در سال
اسهال عفونی شایعنترین عل
ت اسهالخصوصا» در زیر 5 سال و افراد مسن

4. Host defence Gastric acidity Normal peristaltic movement
Normal bacterial flora
استفاده از بی کربنات داروهای ضد اولسر افزایش عفونت – نقش شیر در عفونت های روده –علت تعئاد کم در بیماریزایی مواردی مثل شیگلا ای کولای و مایکوباکتریوم توبرک.ل.زیس بعلت مقاومت انها به محیط اسیدی معده است
حرکات پریستالسیم منجر به خروج می شود موارد ی مثل کلستریدیوم دیفسیل و مواردی مثل کاندیدا و استاف اروئوس فقط از بین رفتن فلور نرمال منجر به بیمای می شوند
عوامل دفاعی مهم است عواملی مثل روتا ویروس و ای کلای انتروپاتوؤن عمدتا» فقط در اطفال
عوامل

5. Inf(s) of Elimantary Tract
Esophagitis : Candia (C.albicans),HSV, CMV
Gastritis :H.pylori
Proctitis :Chlamydia T., HSV, T.Pallidum
Enteric infections
miscellaneous :Crohn,s dis.: Mycobacteria
Homosexuality : Mycobacterium avium
شکایت بالینی خارش ترشحات موکوسی – اکثرا» عفونت های جنسی
ازوفاژیت عفونی معمولا» افرادی که دچار نقص ایمنی

6. Pathogenesis - General mechanism
در مواردی که توکسین در بیرون تشکیل شده باشد (مسموت غدایی ) بنظر بعضی عفونت گوارشی نیست بلکه مسمومیت غدایی است وموواردی مثل مسمومیت غدایی استافبلوکک و بوتولیسم در روده بیمار وجود ندارند
دوز های کم عفونت ئر عواملی مثل ژیلردیا و شیگلا در مراکزی مثل مهد کودک ها و و بیمارستانها می تواند باعث طغیان شود
در مواردی که عامل عفونی وترد خون می شود بغیر از مدفوع کشت خون یا ادرار می تواند مفیذ باشد
21/12/08

7. Some Causes of Diarrhea
Bacteria
Vibrio cholerae
Enterotoxigenic E. coli (ETEC)
Enteropathogenic E. coli (EPEC)
Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)
Campylobacter jejeuni (most common in US)
C.difficile
Viruses
Rotavirus
Corona viruses
Norwalk virus
Adenovirus
Calicivirus
Parasites
Giardia lamblia
Cyclospora and Cryptosporidium

8. History: identifying pathogen
Alternative water sources, consumption of raw or undercooked meat, raw seafood (Vibrio), un pasteurised milk (E coli, Salmonella, campylobacter)
Travel to undeveloped area (wide range pathogens)
Unwell patient contacts (Shigella, E coli, Salmonella, Campylobacter, Giardia)
Recent antibiotic use
Outbreaks
Bloody diarrhea
شایعترین علت علت اسهال مسافرتی در اسی در حد 50% : ای کلای انتروتوکسی ژنیک
علل دیگر بسته به محل ویبریو – روتا ویروس نورواک – سالمونلا و شیگلا و...

9. Dr Ekta, Microbiology
21/12/08

10. Damage resulting from Infection of the GIT
Pharmacologic action of bacterial toxins, local or distant to site of infection e.g. cholera, staphylococcal food poisoning
Local inflammation in response to superficial microbial invasion e.g. shigellosis, amebiasis
Deep invasion to blood or lymphatics; dissemination to other body sites e.g. enteric fever, hepatitis A
Perforation of mucosal epithelium after infection, surgery or accidental trauma e.g. peritonitis, intra- abdominal abscesses.

11. Pathogenic Mechanisms
Toxin production
Enterotoxin
Vibrio cholerae / NCV
Enterotoxigenic E coli
Clostridium difficile (toxin A)
Campylobacter jejuni
Cytotoxin
Shigella spp
Enterohemorrhagic E coli
توکسین ویبریو دو قسمتی است که پس از ورود به سلول باعث تبدیل
توکسین هیت لبیل ای کلی مشابه ویبریو است –این گونه توکسین ها بعلت تشابه انتی ژنی در تست های انتوتوکسین واکنش مثبت می دهند ر
ATP به cAMP شده خروج یون و بدنبال ا
Clostridium difficile (toxin B)
Neurotoxin
Clostridium botulinum
Staphylococcus aureus
Bacillus cerues

12. Indications to send specimens to the laboratory
Specific investigations are not required for most patients.
A laboratory diagnosis is useful for people who:
may have an infection that could benefit from specific therapy,
are at risk of severe complications,
at risk of spreading infection, or
are involved in an outbreak.

13. Specimen Collection and Processing for Microbiology
Feces, and in some cases rectal swabs or Duodenal aspirate
clean container with a tight lid , not be contaminated
delivered to lab within 1 hr, examined within 2 hours of collection
Unpreserved stool specimens should be maintained at refrigerator temperature during storage and transport
سواپ رکتال : 2.5 سانت داخل چرخش کامل – مدفوع روی سواپ دیده شود –پایداری 48 ساعت دذ دمای اطاق –مدفوکساع به ازمایشگاه بذسذ با نگهدارنده 24 ساعت
-رکتال سواپ وقتی که مدفوع نباشددمای اطاق- سواپ رکتال برای توکسین پارازیت و انتی ؤن میروسی مناسب نیست
3 زوط دز یخچال
ع بدون نگهدارنذهتا ی

14. continued
As the stool specimen cools, the drop in pH will inhibit the growth of most Shigella spp. and some Salmonella spp.
Rectal swabs should be placed in a tube transport system :Carry-Blair (most pathogen, incl. Campylobacter,Vibrio), Buffered glycerol (shigella)
It is becoming standard practice to reject stool specimens for bacterial culture and parasite examination from patients who have been hospitalized longer than 3 days . For such patients, examination for the toxins produced by Clostridium difficile is recom- mended.

15. Lab Diagnosis of GIT Infections
Direct wet mount
Ova & parasites
Fecal leukocytes
Lactoferrin : sn & sp=WBC
Gram stain
Campylobacter
Vibrio
Modified Acid fast
استفاده از میکروسکوپ تاریک و فاز کنتراست برای دیدن حرکت دارتینک و ننمای خمیده کمپیلوباکتر – برای دیدن حرکت کمپیلوباکتر اب یا سالین نباید استفاده کرد .
Cryptosporidium
Isospora
Parasites
Trichrome stain

16. AGGLUTINATION General priciple of agglutination : Tow phase reaction :
1-Binding of antigen an antibody
2- Lattice formation ( clumping)

17. bacterial serological tests

18. Lab Diagnosis of GIT Infections
Antigen detection test
Fluorescent antibody stain
E coli 0157:H7
E coli 0157:H7
Campylobacter Spp.
Shiga toxin : EHEC
Shiga toxin, C. difficle
ELISA / LA
الیزا برای ژیارئیا امیب و روتا ویروس هم کاربرد دارد
برای بررسی توکسین دیفسیل نیاز به 20-50میلی مدفوع –سانتزیفیوژ کردن و فیلتر کردن و گذاشتن الیزا
PCR

19. Clostridium difficle :
Culture : anerobbic; at least 96hrs
Tissue culture cytotoxicity assay : gold st. 48hrs
Rapid Elisa : few hours- C.Diffiicile toxin A, or A&B
Latex assay for GD : low specifity –for screening
New Kit : GDH & A/B toxin
Latex GD + PCR : high sen & sp
Colonoscpy : pseudomembranous colitis
علت 25% اسهالهای ناشی از انتی بیوتیک (پنی سیلین-گلیندامایسین-سفالوسپورین ها )

20. Lab Diagnosis of GIT Infections
Culture
BA / MAC / XLD / SS / TCBS / Selenite F broth
Identification tests
Antibiotic susceptibility test – if needed

21. Culture Media
Supportive Medium : BA( TSA+5%sh.Blood): yeast, Staph ,GNB
Slightly selective : MacConkey /EMB : Lactose Neg: vibrio and most pathogen enterobacteriacea,
Moderately selective :inhibit most enterobacteeriacea other than S & Sh : XLD, HE
Highly selective : inhibit some S &Sh: bismuth sulfite, deoxycholate, brilliant green
Enrichment broth: salmonella, campylobacter, Y.enterocolitica : GNB, SF , Campy-thioglycollate : campylobacter.
از بین رفتن فلور نرمال و وجود تعداد زیاذی مثلا» استاف را در محیط ساپوتیئ می توان برریی کرد .اگر کلنی هادر بخش یا پهارم کشت دیدم ی شبیه به سودموناس از نظر
محیط های سلکتیو ساهت در 35 درجه –محیط انریچ : 6-8 ساعت در دمای اطاق
اکسیذاز پک می کنیم اگر کلنی زیاد بود اوروموناس و پلزیوموناس پک می شود
Gلاکتوز مثبت های که د ر مک کانکی میس می شود : بعضی از انواع ویبریو ،ای کلی پاتوؤن بعضی انواع ائروموناس پلزیوموناس

22. در امریکا سالمونلا- شیگلا و کامپیلوباکتر اجباری است و ادروموناس و پلزیومانس هم باید انجام شود . اگر در جای یرسینا زیاد شود ان هم باید جز روتین باشد در جای دیگری اگر وبا زیاد شود ان هم چز روتین می رود (مثل نواحی خلیخی در امریکا )در حالیکه نواحی مرکزی این برسی انجام نمی شود مگر موردی – ای کلای ا 157 بر اسا اتسیدانس بیماری و در موارد اسهال شدید

23. Specimen Processing

24. Selenite F broth Ingredients :
Selenite F broth is an enrichment medium for the isolation of salmonella species and some shigella species from faecal or urine specimens.
Ingredients :
Sodium hydrogen Selenite
Disodium hydrogen phosphate
Peptone
sodium dihydrogen phosphate
Lactose
Sodium Selenite inhibits the growth of Gram-positive bacteria and many Gram-negative bacteria, whereas the salmonellae are not affected.
Sodium selenite is highly toxic at near-neutral pH.
Buffer salts are present to help maintain the pH which may rise as the toxicity decreases . A rise in pH decreases selective activity of Selenite.
A fermentable carbohydrate ( lactose) is also present to provide acid to neutralize the alkali produced when the selenite is reduced by bacteria.

25. Gram Negative (GN) broth is selective enrichment medium used for the cultivation of enteric pathogens including shigella and salmonella It is especially useful when the salmonella or shigella are present in low numbers.

26. Salmonella species Fast Facts
Requires a high microbial load for infection
Culture
Look for LN on MAC
Look for blue green colonies with blk centers on HE
Look for red colonies with blk centers on XLD
Fecal wbc lab test
See rbc’s and wbc’s in stool

27. Salmonella (cont’d)
Salmonella on MacConkey

28. Salmonella on (XLD) inhibits contaminating Gram-positive flora.
Xylose is fermented by practically all coliforms bacteria and Salmonella, except for Shigella
Salmonella decarboxylate lysine,causing the pH to H2S producing bacteria.

29. Salmonella (cont’d) Lactose negative
Negative for indole, VP, phenylalanine deaminase, and urease
Most produce H2S
Do not grow in potassium cyanide
Large and complex group of organisms; grouped by O, H, and Vi (for virulence) antigens

30. Shigella species Fast Facts
Requires a low microbial load
Fecal WBC lab test
Observe blood, WBCs, pus
Culture
Colorless colonies(NLF) on MAC
Blue green colonies of HE
Red/colorless on XLD

31. Shigella (cont’d) Characteristics Non-motile
Do not produce gas from glucose
Do not hydrolyze urea
Do not produce H2S on TSI
Lysine decarboxylase negative
ONPG positive (delayed lactose +)
Possess O and some have K antigens

32. Shigella species Closely related to the Escherichia
All species cause bacillary dysentery
S. dysenteriae (Group A)
S. flexneri (Group B)
S. boydii (Group C)
S. sonnei (Group D)

33. Common Bacterial Agents Causing Diarrhea
Campylobacter jejuni
Most common cause of bacterial diarrhea in the world
Inadequately cooked poultry, untreated water, unpasteurized milk, and exposure to animals with diarrhea
Self-limiting, antibiotics not needed
Manifests with fever, diarrhea and abdominal cramping
Poultry:lمرغ و خروس خانگی –ماکیان

34. Campylobacter jejuni: Fast facts
Grows best at 42 degrees C
Microaerophilic conditions (An atmosphere with reduced O2 (5% O2) with added CO2 (10% CO2)
Several selective media can be used (eg, Skirrow’s medium)
Gram-negative curved rods, “seagull wings”
. محیط مناسب دیگر شارکول-سفاپرازون شکلات اگار -محیط مناسب بوسیله گاز پک قابل تهیه است – جار حاوی شمع مزان اکسیژن کافی را فراهم می نمی کند
شایعترین عفونت گوارشی در امریکاست بیشتر بعت خوردن غذای خوب پخته نشده مرغ و جوجه یا مصرف شیر یا اب الوده

35. Escherichia coli Gastrointestinal Infections
Enteropathogenic (EPEC) – primarily in infants and children; outbreaks in hospital nurseries and day care centers; stool has mucous but not blood; identified by serotyping
Enterotoxigenic (ETEC) – “traveler’s diarrhea”; watery diarrhea without blood; self-limiting; usually not identified
Enteroinvasive (EIEC) – produce dysentery with bowel penetration, watery diarrhea with blood; do NOT ferment lactose; identified via DNA probes

36. Escherichia coli (cont’d)
Enterohemorrhagic (EHEC serotype 0157:H7) – associated with hemorrhagic diarrhea and hemolytic- uremic syndrome (HUS), especially in young children; undercooked hamburger, unpasteurized milk and apple cider have spread the infection; does NOT ferment sucrose; identified by serotyping
Enteroaggregative (EaggEC) – cause diarrhea by adhering to the mucosal surface of the intestine; watery diarrhea; symptoms may persist for over two weeks
Cider شراب یا شربت سیب

37. Escherichia coli (cont’d)
Characteristics
Dry, pink (lactose positive) colony with surrounding pink area on MacConkey

38. Escherichia coli (cont’d)
Ferments glucose, lactose, trehalose, & xylose
Positive indole and methyl red tests
Does NOT produce H2S or phenylalanine deaminase
Simmons citrate negative
Usually motile
Voges-Proskauer test negative

39. E. coli O157:H7 on MAC and SMAC

40. Less Common Agents of GI Illness
Vibrio spp.
Plesiomonas shigelloides
Aeromonas hydrophilia
Yersinia enterocolita

41. Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas
A. General characteristics
1. glucose-ferm, grow on Mac ,Different from enterics: Oxidase-positive,
B. Laboratory diagnosis
1. Specimen collection, transport, processing
a. Vibrio should only be transported in Cary-Blair, Enrichment :peptonated water : because glycerol in buffered glycerol saline is toxic to vibrios
2. Direct detection methods
a. Vibrios: gnr, slightly curved, rapid darting movement
b. Aeromonas: gnr or coccobacilli, straight with round ends
c. Plesiomonas: gnr, single, pairs, short chains, or long filaments
پلزیوموناس یک عضو جدید در انترباکتریاسه است که باعث عفونت گوارسی می شود و با انتی سرم شیگلا واکنش متقاطع می دهد ولی برخلاف آن اکسیداز مثبت است
از ویزگی های مشترک این باکتری ها جز فلور نرمال نیستند مخزن اصلی انها آب های شور است و معمولا“ بدنبال مصرف آب غذاهای الوده خصوصا“ غاهای دریایی –ائروموناس در بجه هاست و لی همیت ان نا مشخص از غلل همولیتیک ارومویک نیز هست
Brack ish : اب شور

42. D. Laboratory diagnosis
3. Culture and identification
a. Media
i. all grow on blood and Mac
ii. may be LFs or NLFs
iii. Thiosulfate citrate bile salts sucrose (TCBS); selective media for vibrio: ferments sucrose and makes yellow colonies on blue-green plate.
b. Colony appearance
i. look like gnrs, Aeromonas may be beta-heme
ii. all are OXIDASE-POSITIVE; we look for ox+ positive that are not Pseudomonas

43. TCBS agar for the recovery of Vibrio sp. Gram stain of Vibrio sp.l

44. Yesinia enterocolitica
Most common form of Yersinia
Found worldwide
Found in pigs, cats and dogs
Human also infected by ingestion of contaminated food or water
Some infections result from eating contaminated market meat and vacuum-packed beef
Is able to survive refrigerator temperatures (can use “cold enrichment” to isolate)
Mainly causes acute gastroenteritis with fever
CIN agar (Cefsulodin-Irgasan
–Nevobiocin agar )

45. Lab Diagnosis of GIT Infections
Report & Interpretations
Simple diarrhea
Antibiotic rarely beneficial
Antibiotics indicated if evidence of invasion
C difficile: stop antibiotics and start on metro / vanco
Isolation of pathogens in stool samples must be notified to public health authority