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6 장 모세관 전기영동 분석법
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모세관 전기영동 분석법 외부에서 전기장에 의해 이온들이 반대 전하 를 띤 전극으로 이동하는 현상 이용 이온들이 움직이는 속도는 전기장의 세기에 직접 비례 비례상수를 전기영동 이동성 (electrophoretic mobility) 분자의 이동성은 평균전하, 크기, 모양, 용매의 성질 등 따름
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What is Capillary Electrophoresis (CE)
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Basic CE Equipment
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Rapid 5-50 min High efficiency 1 million plates/meter High sensitivity 10 -12 -10 -21 mol (10 -4 -10 -15 M) Reproducibility <1% Low sample volume 1-30 nL Low buffer comsumption 5-10 mL Easy operation, quantitation and automation Advantages of CE
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Van Deemter 식 모세관전기영동법 이론단수 50,000 ~ 500,000
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Pharmaceuticals Inorganic ions Industrial chemicals Chiral drugs Carbohydrates Foodstuffs Plants extracts Oligonucleotides Types of Samples Amino acids Peptides Proteins PCR products DNA fragments RNA Bacteria Viruses
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Electrophoresis terminology
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Separation Mechanism
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Factors Controlling EOF Increasing ionic strength, viscosity and additive concentration generally decreases EOF.
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Hydrodynamic flow
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모세관 전기영동에서 이온의 움직임의 속도
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분리능
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Hydrodynamic Injection
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최적 분석을 위한 분석 조건 Joule heating 에 의한 대류 방지 생성열 확산 : 길이가 길고 지름이 작은 모세관 유리 일반적으로 내경이 25~75 μm, 길이가 25~100 cm 정도 전기장의 최고치 25~30 kV 완충액의 낮은 전해질 농도 모세관벽과 시료이온의 상호작용 모세관 벽과 시료 사이의 상호작용으로 피크의 비대칭, 테일링현상 음전하를 띈 모세관에 양전하를 띈 시료의 테일링 1) 흡착될 곳에 용질과 경쟁적으로 작용할 염 (salt) 을 첨가한다 2) 모세관 벽은 polyacrylamide, poly (vinyl-pyrrolidinone) 등과 같은 비 활성물질로 변형시키거나 coating 3) 단백질의 경우 완충액의 농도를 증가, 높은 pH 를 사용하여 단백질이 음전하를 띄도록 한다.
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1.Free solution capillary electrophoresis 2.Micellar electrokinetic capillary chromatography 3.Capillary gel electrophoresis 4.Capillary isoelectric focusing 5.Capillary electrochromatography 6.Chiral capillary electrophoresis
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Free solution capillary electrophoresis (FSCE) Capillary zone electrophoresis (CZE) differences in electrophoretic mobilities electrolyte solution of charged molecules Separation Modes for CE (1)
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Separation of dihydroxybenzoic acid
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Effect of pH on Analyte Charge
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Micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC) Micellar electrokinetic chromatography (MEKC) partioning between micelle and free solution micellar electrolyte Separation Modes for CE (2)
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MECC Separation Mechanism
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Micellar electrokinetic chromatogram 30 mM SDS in 50 mM phosphate/100 mM borate (pH 7), 15 kV
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Micellar electrokinetic chromatogram 그림 6-6 광학 이성질체인 amphetamine (A), methamphetamine (B) 의 모세관 전기영동 분석. 100 mM 인산 완충용액 (pH 2.5) 에 아무것도 넣지 않거나, CD, cyclodextrin; BCD, beta cyclodextrin; HPCD, hydroxypropyl cyclodextrin; CMCD, carboxymethyl beta cyclodextrin 을 첨 가하여 분석 결과 [From Y. J. Heo, et al. J. Chromatogr. B 2000, 741, 221.]
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Capillary gel electrophoresis (CGE) molecular sieving/differences in electrophoretic mobilities polyacrylamide gel, SDS-PAGE Separation Modes for CE (3)
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Capillary isoelectric focusing (CIEF) differences in isoelectric points electrolyte/ampholyte pH gradient Separation Modes for CE (4)
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Capillary electrochromatography (CEC) partitioning in stationary phases organic solvents in buffers Separation Modes for CE (5)
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Comparison of CEC and HPLC Hypersil C 18, methanol/Tris HCl (25 mM, pH 8) = 80:20 1.thiourea 2.butylparaben 3.pentylparaben 4.hexylparaben 5.naphthalene 6.heptylparaben 7.fluorene 8.anthracene 9.fluoranthene
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Detection Principles Representative Detection limit (moles detected) Analytes Spectrophotometric Absorption 10 -15 ~ 10 -13 amino acides, proteins, peptides bases, nucleosides, nucleotides Fleorescence 10 -17 ~ 10 -20 Precolumn deriv.8 x 10 -16 labeled amino acides, peptides, proteins On-column deriv.2 x1 0 -17 Postcolumn deriv.5 x 10 -17 Indirect fluorescenc4 x 10 -17 Thermal lens4 x 10 -17 amino acids in urine Raman1 x 10 -15 Refractive index Mass Spectrometric1 x 10 -17 SDS, dopamne, epinephrine, quaternary ammonium salts amino acids Electrochemical Conductivity1 x 10 -16 carboxylic acids, metal ions inorganic ions Amperometric7 x 10 -19 catechol, catecholamine, dopamine, epinephrine, serotonine, etc. Radiometric1 x 10 -19 ATP, CTP, TTP Detection modes developed for capillary electrophoresis
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그림 6-9 항경련제 약물의 모세관 전기영동 분석. (A) 표준시료의 혼합물 (1, ethosuccimide; 2, primidone; 3, valproic acid; 4 phenobarbital; IS, hexobarbital; 5, phenytoin; 6, carbamazepine, (B) blank 혈청에 IS 를 첨가 후 추출한 시료, (C) blank 혈청에 IS 와 약물을 첨가한 후 추출한 시료, (D-F) 각각 항경련제 약물을 투여한 환자 의 혈장시료를 추출한 시료. 50 mM SDS 를 포함한 25 mM 인산 완충용액 (pH 7.0) 를 이용하여 분석한 결과 [From K. J. Lee et al, J. Chromatogr. 1992, 608, 243-250] 모세관 전기영동의 응용
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그림 6-10 재조합 단백질의 모세관 전기영동 분석. a, 재조합 단백질 Nm23-H1; b, 재조합단백질 Nm23-H2; c, Nm23-H1 과 Nm23-H2 의 혼합물 ; d, 적혈구에서 분리정제한 Nm23. 20 mM sodium borate (pH 9.6) 에서 모세관전기영동 [From Y. J. Heo, et al., J. Chromatogr. A 1997, 781, 251.] 모세관 전기영동의 응용
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