1. 6 장 모세관 전기영동 분석법

2. 모세관 전기영동 분석법 외부에서 전기장에 의해 이온들이 반대 전하 를 띤 전극으로 이동하는 현상 이용 이온들이 움직이는 속도는 전기장의 세기에 직접 비례 비례상수를 전기영동 이동성 (electrophoretic mobility) 분자의 이동성은 평균전하, 크기, 모양, 용매의 성질 등 따름

3. What is Capillary Electrophoresis (CE)

4. Basic CE Equipment

5. Rapid 5-50 min High efficiency 1 million plates/meter High sensitivity 10 -12 -10 -21 mol (10 -4 -10 -15 M) Reproducibility <1% Low sample volume 1-30 nL Low buffer comsumption 5-10 mL Easy operation, quantitation and automation Advantages of CE

6. Van Deemter 식 모세관전기영동법 이론단수 50,000 ~ 500,000

7. Pharmaceuticals Inorganic ions Industrial chemicals Chiral drugs Carbohydrates Foodstuffs Plants extracts Oligonucleotides Types of Samples Amino acids Peptides Proteins PCR products DNA fragments RNA Bacteria Viruses

8. Electrophoresis terminology

9. Separation Mechanism

10. Factors Controlling EOF Increasing ionic strength, viscosity and additive concentration generally decreases EOF.

11. Hydrodynamic flow

12. 모세관 전기영동에서 이온의 움직임의 속도

13. 분리능

14. Hydrodynamic Injection

15. 최적 분석을 위한 분석 조건 Joule heating 에 의한 대류 방지 생성열 확산 : 길이가 길고 지름이 작은 모세관 유리 일반적으로 내경이 25~75 μm, 길이가 25~100 cm 정도 전기장의 최고치 25~30 kV 완충액의 낮은 전해질 농도 모세관벽과 시료이온의 상호작용 모세관 벽과 시료 사이의 상호작용으로 피크의 비대칭, 테일링현상 음전하를 띈 모세관에 양전하를 띈 시료의 테일링 1) 흡착될 곳에 용질과 경쟁적으로 작용할 염 (salt) 을 첨가한다 2) 모세관 벽은 polyacrylamide, poly (vinyl-pyrrolidinone) 등과 같은 비 활성물질로 변형시키거나 coating 3) 단백질의 경우 완충액의 농도를 증가, 높은 pH 를 사용하여 단백질이 음전하를 띄도록 한다.

16. 1.Free solution capillary electrophoresis 2.Micellar electrokinetic capillary chromatography 3.Capillary gel electrophoresis 4.Capillary isoelectric focusing 5.Capillary electrochromatography 6.Chiral capillary electrophoresis

17. Free solution capillary electrophoresis (FSCE) Capillary zone electrophoresis (CZE) differences in electrophoretic mobilities electrolyte solution of charged molecules Separation Modes for CE (1)

20. Separation of dihydroxybenzoic acid

21. Effect of pH on Analyte Charge

23. Micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC) Micellar electrokinetic chromatography (MEKC) partioning between micelle and free solution micellar electrolyte Separation Modes for CE (2)

26. MECC Separation Mechanism

29. Micellar electrokinetic chromatogram 30 mM SDS in 50 mM phosphate/100 mM borate (pH 7), 15 kV

30. Micellar electrokinetic chromatogram 그림 6-6 광학 이성질체인 amphetamine (A), methamphetamine (B) 의 모세관 전기영동 분석. 100 mM 인산 완충용액 (pH 2.5) 에 아무것도 넣지 않거나, CD, cyclodextrin; BCD, beta cyclodextrin; HPCD, hydroxypropyl cyclodextrin; CMCD, carboxymethyl beta cyclodextrin 을 첨 가하여 분석 결과 [From Y. J. Heo, et al. J. Chromatogr. B 2000, 741, 221.]

31. Capillary gel electrophoresis (CGE) molecular sieving/differences in electrophoretic mobilities polyacrylamide gel, SDS-PAGE Separation Modes for CE (3)

33. Capillary isoelectric focusing (CIEF) differences in isoelectric points electrolyte/ampholyte pH gradient Separation Modes for CE (4)

35. 1 2 34

36. Capillary electrochromatography (CEC) partitioning in stationary phases organic solvents in buffers Separation Modes for CE (5)

38. Comparison of CEC and HPLC Hypersil C 18, methanol/Tris HCl (25 mM, pH 8) = 80:20 1.thiourea 2.butylparaben 3.pentylparaben 4.hexylparaben 5.naphthalene 6.heptylparaben 7.fluorene 8.anthracene 9.fluoranthene

45. Detection Principles Representative Detection limit (moles detected) Analytes Spectrophotometric Absorption 10 -15 ～ 10 -13 amino acides, proteins, peptides bases, nucleosides, nucleotides Fleorescence 10 -17 ～ 10 -20 Precolumn deriv.8 x 10 -16 labeled amino acides, peptides, proteins On-column deriv.2 x1 0 -17 Postcolumn deriv.5 x 10 -17 Indirect fluorescenc4 x 10 -17 Thermal lens4 x 10 -17 amino acids in urine Raman1 x 10 -15 Refractive index Mass Spectrometric1 x 10 -17 SDS, dopamne, epinephrine, quaternary ammonium salts amino acids Electrochemical Conductivity1 x 10 -16 carboxylic acids, metal ions inorganic ions Amperometric7 x 10 -19 catechol, catecholamine, dopamine, epinephrine, serotonine, etc. Radiometric1 x 10 -19 ATP, CTP, TTP Detection modes developed for capillary electrophoresis

46. 그림 6-9 항경련제 약물의 모세관 전기영동 분석. (A) 표준시료의 혼합물 (1, ethosuccimide; 2, primidone; 3, valproic acid; 4 phenobarbital; IS, hexobarbital; 5, phenytoin; 6, carbamazepine, (B) blank 혈청에 IS 를 첨가 후 추출한 시료, (C) blank 혈청에 IS 와 약물을 첨가한 후 추출한 시료, (D-F) 각각 항경련제 약물을 투여한 환자 의 혈장시료를 추출한 시료. 50 mM SDS 를 포함한 25 mM 인산 완충용액 (pH 7.0) 를 이용하여 분석한 결과 [From K. J. Lee et al, J. Chromatogr. 1992, 608, 243-250] 모세관 전기영동의 응용

47. 그림 6-10 재조합 단백질의 모세관 전기영동 분석. a, 재조합 단백질 Nm23-H1; b, 재조합단백질 Nm23-H2; c, Nm23-H1 과 Nm23-H2 의 혼합물 ; d, 적혈구에서 분리정제한 Nm23. 20 mM sodium borate (pH 9.6) 에서 모세관전기영동 [From Y. J. Heo, et al., J. Chromatogr. A 1997, 781, 251.] 모세관 전기영동의 응용