1. Enzyme Kinetics Enzyme activity Score
Student A
Score
Enzyme activity
Student B
Student C
Exam Chapters
Substrate concentration
其實 學生很像是酵素，拼命讀書以得到好的考試成果，但每一個學生的讀書或考試表現都不很一樣 (如上圖甲乙丙生)。通常考試章數 (基質濃度) 越多，學生準備考試的效率會好一點 (考 1-3 章)，但若考試範圍太多 (考 4 章以上)，通常考生會應付不來，只能達到一個飽和點 (或乾脆放棄了)。
同時，若以不同章數來考學生，不同的學生就會有不同的表現，如上面每個學生的表現曲線不同；考試章數少的時候 (考 1-2 章)，乙生的表現甚至高過甲生。酵素也是如此，有些酵素的表現較佳，有些則較懶散，也各有不同的表現曲線。
在觀察這些情況時，隱約可以發現一件事實，就是不管考得好不好，考試前學生大多會開始拿起課本。這點也就是後來動力學研究的最基本起始點，酵素一定要先與基質結合後，才能進行催化作用。
Increase the substrate concentration,
observe the change of enzyme activity
Juang RH (2004) BCbasics

2. Sucrose Glucose Fructose + Invertase (IT) IT Reducing sugars
Non-reducing sugar
Reducing Power IT
Sucrose
Glucose
Fructose +
HOCH2 O OH
HOCH2 O OH O
HOCH2 OH
HOCH2 HO O 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 1 2 b b
H2O 1 2 3 4 5 6
CHO
H-C-OH
HO-C-H
H2-C-OH
H2C-OH
C=O
HO-C-H
H-C-OH
H2-C-OH
HOCH2 O
Michaelis 及 Menten 兩位以當時一個普遍研究的酵素 invertase (轉化脢) 作為研究對象，其催化反應如上圖所示，可以把非還原糖的蔗糖，轉化成為兩個具有還原力的單糖 (葡萄糖及果糖)。因此做實驗時，只要把蔗糖加入轉化脢後，測量所生成還原力的增高，即可得知此酵素的活性。
他們在進行實驗時，觀察到一件事實： 當酵素的量固定時，若增加基質的量，則反應速率會跟著上升；但此種上升並非沒有限制，當基質增加到某一濃度後，反應速率即不會再增加了，反應速率似乎是受限於其中的酵素分子數量。因此，確定酵素可能要先與基質結合，才能進行催化反應。 O
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3. Increase Substrate Concentration2 1 3 4 5 6 7 8 S + E ↓ P
Product 80 60 40 20
(in a fixed period of time)
其實 動力學實驗很簡單，分別在各試管內加入不同量的基質，並以相同的酵素量進行催化反應，在固定時間內測定其所生成的產物。由結果可以發現，隨著基質濃度上升，反應也越快速，但基質濃度太高時，酵素的活性 (生成物濃度) 便無法再上升了。
其結果直接作圖如上曲線，此一曲線是雙曲線的一股，並可以用數學式描述之。
Substrate (mmole)
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4. Essential of Enzyme Kinetics
Steady State Theory E E E S + + P S
In steady state, the production and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the
concentration of transition state keeps a constant.
由 Michaelis 與 Menten 的觀察證實了一個想法，就是酵素 [E] 與基質 [S] 一定要先結合在一起成為 [ES]，然後才能得到生成物 [P]。因此 [ES] 的生成速度與消失速度一樣，則反應液中的 [ES] 濃度為恆定，此稱為 Steady state theory。我們的確可以在實驗中，觀察到反應溶液中有穩定濃度的 [ES]。由此引發了整個酵素動力學的基本研究。
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5. Constant ES Concentration at Steady StateP ES E
後來 的研究發現，確實有酵素與基質的結合體存在，此一結合體 ES 的濃度在整個反應過程中，呈現一平衡狀態。在酵素與基質剛混合後，尚未達到 ES 的平衡狀態時，特稱之為 pre-steady state。
Reaction Time
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6. An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)
1) Use predefined amount of Enzyme → E
2) Add substrate in various concentrations → S (x 軸)
3) Measure Product in fixed Time (P/t) → vo (y 軸)
4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate → Vmax
5) When y = 1/2 Vmax calculate x ([S]) → Km
Vmax S vo
1/S 1 vo
1/2
- 1 Km
上圖 是進行酵素動力學的實際操作過程，所需要的設備通常相當簡單，操作方法一般也並不很困難，要看該酵素活性分析方法之難易而定。但由動力學實驗所得的資料很重要，可以得知一個酵素與其基質之間的關係，以及該酵素的最大活性，甚至可能推得酵素的作用機制。
通常大學部所開的生化實驗中，都是以 invertase 作為實驗範例，進行當時 Michaelis 與 Menten 的動力學觀察。 1
Vmax
Juang RH (2004) BCbasics Km
Double reciprocal
Direct plot

7. A Real Example for Enzyme Kinetics
Velocity
Substrate
Product
Double reciprocal
Data
[S]
Absorbance
v (mmole/min)
1/S
1/v no 1 2 3 4
0.25
0.50
1.0
2.0
0.21
0.36
0.40
0.46 →
0.42
0.72
0.80
0.92 4 2 1
0.5
2.08
1.56
1.35
1.16
(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmole
(2) Reaction time was 10 min
2.0
1.0
1/v
1.0
0.5 v
1.0
Direct plot
Double reciprocal
-3.8
請 利用上面的數據，自行作圖看看是否與結果的圖形相符。
本實驗應該有一組控制組 (編號 0)，不加有基質 ([S] = 0)，如法加酵素經過反應後，所得到的吸光值為此一反應的背景值，上述數據應該已經扣除此背景值。
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1/[S]
[S]