1. Classification of Proteases
　Family Example 　Mechanism Specificity Inhibitor
E72
H69 Zn 2+
H196
Metal
Protease
Carboxy-
peptidase A
Chymotrypsin
Trypsin
Papain
Pepsin
Renin
Non-
specific
Aromatic
Basic
polar
EDTA
EGTA
DFP
TLCK
TPCK
PCMB
Leupeptin
Pepstatin
H57
D102
S195-O-
Serine
Protease
C25-S-
H195
Cysteine
Protease
凡是 可以水解胜肽鍵的酵素，均統稱為蛋白脢。蛋白脢的種類非常多，我們大致歸納為四大類，均依其催化特性來命名。例如 metal protease 是因為分子中含一金屬離子，此金屬離子不但可維持酵素的正確分子構形，也可以參與催化反應；Ser 及 Cys protease 是因為催化區上含有一個 Ser 或 Cys 胺基酸為主要的催化機團；而 Asp protease 也是因為分子上需要有兩個 Asp 基團，以便抓住水解所需的水分子。
每一類蛋白脢家族內，其成員的催化機制都相同，但催化目標的專一性不同；例如 Ser 家族內的 trypsin 嗜好水解鹼性胺基酸，而 chymotrypsin 喜歡較大的芳香基團。
以下將把重點放在 Ser 蛋白脢的催化區，看其催化鐵三角如何作用，以及此家族在分子演化上的奇特表現。最有趣的是，這種有效的催化鐵三角，居然也會被其它酵素盜用 (或是純屬雷同？)。
D215
D32
H2O
Aspartyl
Protease
Juang RH (2004) BCbasics

2. Modification of Subtilisin and Its Activity Change
Active Site Relative
Modification Triad: Ser His Asp activity
No enzyme
Subtilisin ● ● ● ,000,000,000
Ser, His & Asp → Ala ○ ○ ○ 4,000
His & Asp → Ala ● ○ ○ 37,000
Ser → Ala ○ ● ● 5,000
Asp → Ala ● ● ○ ,000
Asn155 → Leu ● ● ● 10,000,000
(Asn155 stabilizes transition state)
為了 研究 Ser protease 的催化區，有人把 subtilisin 催化鐵三角上面的胺基酸修改，再看影響修飾後的蛋白脢活性大小。結果發現 Ser195 是絕對不可以改變的重要胺基酸，His57 及 Asp102 次之。同時，若把可以穩定過渡狀態分子的 Asn155 改成不具電荷的 Leu，活性也會下降一千倍。因此，這三個重要胺基酸是不能任意改變，所有 Ser protease 家族成員，都有這三個胺基酸在固定的位置。
Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.245

3. Serine Protease and AchE
Chymotrypsin – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Leu –
Trypsin – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Val –
Elastase – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Leu –
Thrombin – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Phe –
Plasmin – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Leu –
Acetylcholinesterase – Gly – Glu – Ser – Ala – Gly – Gly – Ala –
Ser 195
Chymotrypsin – Val – Thr – Ala – Ala – His – Cys – Gly –
Trypsin – Val – Ser – Ala – Gly – His – Cys – Tyr –
Elastase – Leu – Thr – Ala – Ala – His – Cys – Ile –
Thrombin – Leu – Thr – Ala – Ala – His – Cys – Leu –
Plasmin – Leu – Thr – Ala – Ala – His – Cys – Leu –
Acetylcholinesterase – – – – – – – – – – – – – His – – – – – – – –
His 57
Chymotrypsin – Thr – Ile – Asn – Asn – Asp – Ile – Thr –
Trypsin – Tyr – Leu – Asn – Asn – Asp – Ile – Met –
Elastase – Ser – Lys – Gly – Asn – Asp – Ile – Ala –
Thrombin – Asn – Leu – Asp – Arg – Asp – Ile – Ala –
Plasmin – Phe – Thr – Arg – Lys – Asp – Ile – Ala –
Acetylcholinesterase – – – – – – – – – – – – – – Asp – – – – – – –
把 Ser 家族幾個成員拿出來比較，看催化鐵三角附近胺基酸序列的差異性如何。最重要的 Ser 附近的胺基酸保守性非常高，其它地方也都是半保守性地取代 (即極性取代極性、非極性取代非極性)。
成員中有一個 acetylcholinesterase (AchE) 似乎是認養來的，AchE 也有催化鐵三角，但是整體的胺基酸序列並不太像 (因此上圖無法列出比較的序列)，好像沒有『血緣』關係。的確如此，AchE 原來並非 Ser 家族的嫡系成員，只是趨同演化出具有與鐵三角類似的催化機制。
Asp 102
Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.244

4. AchE Has Similar Catalytic Mechanism
O CH3
CH3–C–O–CH2–CH2–N–CH3
CH3 +
AchE
O - C H O
CH3–C
CH3
O–CH2–CH2–N–CH3
H CH3 +
O - C H H
AchE
H2O
Acylation↑
CH3
HO–CH2–CH2–N–CH3 + O
CH3–C–OH
AchE O C H
CH3–C
↓Deacylation
H-O-H
AchE
O - C H
Acetylcholinesterase 的催化機制與胜肽鍵水解極相似，活性區有高反應性的 Ser 以及 His 和 Asp 的質子接力，也分成 acylation 及 deacylation 兩個階段。
Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.243

5. Different Enzymes Might Adopt Same Mechanism
← Useful
↙ Amusing
Hi, Everybody!
Sesame Triad
看來 它們是各自發展出類似的催化機制，一個有用的組合不但會被重複使用，還會有趨同演化的情形，天底下大家想的真是都差不多。
Juang RH (2004) BCbasics

6. Acetylcholinesterase
Convergent and Divergent
Evolution
Molecular
Thyroglobulin C O
Acetylcholinesterase
hydrolyze
acetylcholine
Ester bond
Divergent evolution
Asp--His--Ser
Convergent evolution
Peptide bond
Serine Protease C N H O
Acetylcholinesterase (AchE) 是與 Ser protease 家族完全無關的一個酵素，它獨立演化出類似 Ser 催化鐵三角的 Asp-His-Ser 活性區，其作用模式也與 Ser protease 類似，但催化的是水解 acetylcholin 的 ester bond 而非 peptide bond；事實上，這兩種鍵結的水解方式，也極為相像。這種由不相關的前驅物開始，卻發展出相同的催化機制，稱為 趨同演化；而 Ser protease 家族則是由一個相同的始祖開始，趨異演化 成各個不同的家族成員。
因此，演化現象不但在鉅觀的生物圈發生，同時也在分子層次的微觀世界上演。
Chymotrypsin
Trypsin
Elastase
Thrombin
Plasmin
Juang RH (2004) BCbasics