1. Recombinant protein expression. Other alternatives
Elvira Marín – Felipe Clemente
WG1 - Protein expression UCM
La Cristalera – Miraflores – 10/12/12

2. Expression (IVTT) and purification (GST)
Unkown proteins cloned
̴ 260 Unkown proteins
Cloned in pANT7_cGST
Dr. Manuel Fuentes
Chromosome 16
WG1
25 new proteins
Digest with
restriction enzymes
Sequencing
Expression (IVTT) and purification (GST)
Mass spectrometry
(MRM)

3. Gateway cloning system
Unkown proteins UN-CLONED
Chromosome 16
Unkown proteins
Cloned in pANT7_cGST
Design primers
Gateway cloning system
pDONR221
(recombinase)
Para todas aquellas proteínas que después de los ensayos de shotgun no se encuentre y que tampoco estén disponibles en la colección de Manuel Fuentes, habrá que subclonarlas para su estudio, cosa que implica mucho más tiempo y dinero para la obtención de la proteína para continuar con los estudios de MRM.
Master clone

4. Expression (IVTT) and purification (GST)
Unkown proteins uncloned
pANT7_cGST
(recombinase)
Digestion and Sequencing
Expression (IVTT) and purification (GST)
Mass spectrometry
(MRM)

5. Protein expression
¿Compatibilidad entre los vectores?

6. Protein expression systems
Prokaryotes
Bacteria
Eukaryotes
Yeast
Mammalian
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
Pichia pastoris
CHO, HeLa, BHK
Células CHO (ovario de hámster chino), HeLa (carcinoma cervical humano), BHK (células de riñón de hámster sirio)

7. POST-TRANSLACTION MODIFICATION
Protein expression systems
LOW
HIGH
SPEED
COST
YIELD
POST-TRANSLACTION MODIFICATION
Mammalian
Yeast
Bacteria
Yeast
Bacteria
Mammalian
Mammalian
Bacteria
Mammaliam: HeLa, Yeast: Pichia pastoris, Bacteria: E. coli
La elección del sistema de expresión viene determinada por los rendimientos que se quieran obtener y la calidad de la proteína expresada. Lo primero que hay que analizar es el número de puentes S-S, la masa de la proteína, las modificaciones post-traduccionales deseadas y el lugar de expresión de la proteína.
La expresión en E. coli suele ser la forma más rápida de expresar una proteína, pero se pierden la mayoría de las modificaciones post-traduccionales presentes en las células eucariotas, aunque existen varias herramientas para solventar dichos problemas. La expresión en Pichia o sistemas basados en células de mamíferos permiten un buen plegamiento de las proteínas al tener las modificaciones post-traduccionales aunque son más caros y lentos.
Bacteria
Mammalian

8. Protein expression systems
N.I. I M
E. coli
Yeast
Mammalian
El paso previo a la expresión de una proteína recombinante es el análisis bioinformático de sus propiedades.
El destino final de la proteína recombinante también es muy importante a la hora de elegir el sistema de expresión, los requisitos son diferentes en función de si se va a emplear para estudios estructurales, ensayos de actividad in vitro, generación de anticuerpos o estudios in vivo.
Se requieren vectores compatibles entre los distintos sistemas de expresión.
El ratio de producción de proteína: traducción y plegamiento es 10 veces superior en E. coli con respecto a las células eucariotas cosa que favorece la formación de cuerpos de inclusión de las proteinas eucariotas.

9. E. coli compartments Advantages Disadvantages Periplasm Cytoplasm
Simple purification
Proteolysis is less extensive
Improved folding (S-S formation)
Disadvantages
Signal does not always
facilitate export
Inclusion bodies may be formed
Periplasm
Inclusion bodies:
easy purification
protection from proteases
inactive protein (non-toxic)
Higher protein yield (until 30% Biomass)
Simpler plasmid construct
Inclusion bodies:
protein folding
denaturation/refolding
Cytoplasm
Los cuerpos de inclusión se forman con proteínas eucariotas y en menor medida con procariotas, es dependiente de la sobreexpresión de proteínas. Un cuerpo de inclusión está formado mayoritariamente por una única proteína.
- Promotores fuertes o débiles (T7 o T5) (no saturar la maquinaria traduccional bacteriana)
Secreción al espacio periplasmico para la formación de puentes disulturo
Distintos orígenes de replicación que permiten controlar el número de copias
Con proteínas de fusión y cofactores para ayudar al plegamiento de las proteínas recombinantes
Múltiples etiquetas, N- o C-terminal, que permiten la identificación y purificación de la proteína
El sistema Dsb es el responsable de la formación de los puentes disulfuro y normalmente la secreción al periplasma es via el sp de pelB. E. coli does not support enzyme-mediated N-linked glycosylation, O-linked glycosylation, amidation, hydroxylation, myristoylation, palmitation, or sulfation
Less extensive proteolysis
Simple purification
Improved folding
Usually no secretion
Cell lysis
Extracellular

10. Fusion partners to the recombinant protein
Maltose binding protein (MBP)
Glutathione-S-transferase (GST)
N-utilization substrate (NusA)
GST y la MBP además de favorecer el plegamiento de la proteína recombinante, se pueden utilizar como etiquetas para la posterior purificación.
Small ubiquitin-modifier (SUMO)
Thioredoxin

11. Pichia pastoris vs Saccharomyces cerevisiae
Advantages P. pastoris and S. cerevisiae
Short doubling time
Readily manipulated genome
Improved folding and post-translational modification
Expression of similar genes and compatible vectors
Better yield of recombinant protein (higher cell density)
Methylotrophic yeast (methanol as its only carbon source)
Strongly methanol induced promoters
(alcohol oxidase genes: AOX1 and AOX2)
Optimal growth pH
Extremely low levels of endogenous protein secretion
Expression vectors integrated in the genome
Disulfide bond formation and glycosylation modifications
S. cerevisiae
P. pastoris
Preference for respiratory growth P. pastoris (S. cerevisiae prefers fermentation) and which allows higher cell densities
P. pastoris culture can reach 120 g/l of dry cell weight density.
Yeast has the posttranslational capacity to add glycans at both specific asparagine residues (N-linked) and serine/threonine residues (O-linked).

12. Expression on mammalian cells
All posttranslational modifications
Highest folding capacity (antibodies…)
Secreted recombinant proteins for an easier purification rather than intracellular production
Mammalian cells contain the most superior folding and disulfide bond formation when compared to other expression hosts. The N-linked and O-linked glycan structures formed by mammalian cells are extremely varied and are not only dependent on the protein but also on the mammalian cell type used as the expression host ( Jenkins et al., 1996). Furthermore, the cell culture conditions such as nutrient content, pH, temperature, oxygen levels and ammonia concentration can significantly affect the glycosylation profile (Butler, 2006).
Stably transfected CHO few grams per liter
Lowest yield
Transfection more complex than plasmid transformation
Stable or transient transfection (takes longer to obtain stable transformants)

13. Protein expression systems summary
Advantages
Disadvantages
Fastest expression method (days)
Inexpensive bioproduction media and
high density biomass
Simple process scale-up
Well characterized genetics
Limited posttranslational modifications
Unsoluble proteins and not correctly folded
Bacteria
Rapid expression method (weeks)
Inexpensive bioproduction media and
high density biomass
Most posttranslational modifications
High folding capacity
N-linked glycan structures different from mammalian forms
Yeast
Transient-transfection
Moderate rapid expression method (weeks)
All posttranslational modifications and
high folding capacity
Low density biomass and expensive
bioproduction media
Difficult process scale-up
Mammalian
Stable-transfection
All posttranslational modifications and
high folding capacity
Low density biomass and expensive
bioproduction media
Difficult process scale-up
Longest expression method (months)
Mammalian

14. Elvira Marín – Felipe Clemente WG1 - Protein expression UCM
Dra. Concha Gil
Dr. Manuel Fuentes

16. E. coli expression systems
N.I. I M
La expresión en E. coli es un sistema rápido de producción de proteína por el corto tiempo de generación que tiene, alrededor de 20 min dependiendo de la cepa en cuestión. La solubilidad de cada proteína es intrínseca a su función, origen y su microambiente celular.
ETAPAS:
Amplificación por PCR del gen de interés
Obtención del vector de clonado
Digestión de ambos productos con enzimas de restricción
Ligación y transformación en el sistema elegido
Selección clonar del organismo con el vector recombinante
Cultivo del clon e inducción de la expresión proteica