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ISSR 分子标记与其在银杏系统 分类研究上的应用 程勤贤2004.11.30
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银杏 (Ginkgo biloba) 是裸子植物银杏纲中唯一现存 的中生代孑遗植物。雌雄异株, 染色体数目为 2 n =24( 陈学森等,1996) 。银杏对气候的适应性较强, 分布 于温带、暖温带和亚热带地区,在中国被广泛栽培, 至今已有近 1000 年的栽培史 (Dell Tredici et al,1992) 。 现栽培银杏分布于我国的 24 个省区, 国外现栽培的银 杏都源自中国 ( 林协,1965) 。
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我国银杏资源非常丰富,但并非取之不竭,个 体之间的亲缘关系的鉴定可以为合理有效的利用银 杏资源及培育新品种提供基础,有益于整个银杏产 业的可持续发展。了解银杏亲缘关系还可以阐明植 物界的自然系统,这也是植物分类学的任务之一, 是保护生物遗传多样性的重要部分。
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作为单科属植物, 由于长期的天然杂交和人工选择, 银杏的种子和叶片发生了明显的变异, 根据这些变 异, 有的学者在种之下划分了变种、变型和类型。 不同的学者从不同的变异角度考虑就有不同的品种 划分。 Carriere 根据银杏冠形和枝、叶形态、叶的 大小和颜色将银杏划为 8 个种,有垂枝银杏,裂叶 银杏,斑叶银杏,黄叶银杏,叶籽银杏等;曾勉根 据银杏种子大小和形状将银杏分为 3 个变种;何凤 仁根据银杏种核的长度比例和两个中轴线交会点的 位置划为 5 大类, 长子、佛子、马铃、梅核、圆子, 每类包括若干品种。
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这些分类方法为银杏研究和生产解决了许 多基本问题,但是这些传统的形态学分类法 如植物解剖学、植物胚胎学、孢粉学、植物 化学、细胞学基本上停留在表型水平,这往 往受环境因素、发育阶段等条件的限制,鉴 定结果不可靠。
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DNA 分子标记技术是近年来才应用于植物分类研 究的, 它从分子水平上直接检测其差异,标记数量是 无限的,而且稳定性高。与其他分类方法相比分子 标记具有以下优点 : ①直接以DNA的形式表现, 不受组织特异性、发育阶 段、季节、环境等限制 ; ②数量多, 遍及整个基因组 ; ③多态性高 ; ④表现为中性, 不影响目标性状的表达, 与不良性状无必 然的连锁 ; ⑤有些分子标记表现为共显性, 能够鉴别物种的杂合、纯 合状态。 近年来, 该技术发展迅猛, 成为研究林木系统的有力 工具。
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目前广泛应用的分子标记主要有 : RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism ) 限制性 片段长度多态性 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs) 随机扩增多态 性DNA AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 扩增片段 长度多态性 SSR(Simple Sequence Repeats) 简单序列重复亦称微卫星 ISSR(Inter Simple Sequence Repeat) 锚定微卫星 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 单核苷酸多态性
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1.ISSR 的技术原理 ISSR 标记即简单重复间序列,是 Zietkiewicz 等 (1994 )发展的一种新的分子标记。基因组中分布 有大量的重复序列,根据其分布特征可分为散在重 复序列和串联重复序列,微卫星(即 SSR )是一种 高度串联重复序列,重复基序仅 2 ~ 6bp ,分布于常 染色质区,是真核生物基因组重复序列的主要组成 部分,均匀分布于基因组中,正是基于基因组这种 特点才出现了 SSR 和 ISSR 技术。
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ISSR 分子标记是在 SSR 标记基础上发展起来的,其基本 原理 ( 示意图如下 ) 在 SSR 的 5’ 或 3’ 端加锚 l ~ 4 个嘌呤或嘧啶 碱基,然后以此为引物,对两侧具有反向排列 SSR 的一段基 因组 DNA 序列进行扩增。在 SSR 的 3, 端或 5, 端锚定 1-4 个简并 碱基的优点是在基因组上只有那些与锚定的核苷酸匹配的位 点才能被靶定,因而避免了 SSR 在基因组上的滑动大大提高 了 PCR 扩增的专一性。
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ISSR 的重复序列和锚定碱基是随机选择的,扩增 产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后,每个 引物可以产生比 RAPD 方法更多的扩增片段,它在 引物设计上比 SSR 技术简单得多,不需知道 DNA 序 列即可用引物进行扩增,又可以揭示比 RFLP 、 RAPD 、 SSR 更多的多态性。因此, ISSR 标记是一 种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的 DNA 指纹技术。 ISSR 标记呈孟德尔式遗传,在多数 物种中是显性的,目前己广泛用于植物品种鉴定、 遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生 态学研究中。
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表 1 葛永奇等对银杏 5 个群体 66 个个体进行扩增的 13 种有效 ISSR 引物的特点
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图 2 引物 UBC845 扩增TM群体 15 棵植株基因组 DNA 的 ISSR 电泳图
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2. ISSR 的操作步骤 2.1 银杏总 DNA 的提取 采用改良 CTAB 法( Doyle,1991 )略加以改 进,提取银杏叶片基因组 DNA 。银杏叶中含有 多种黄酮类、银杏内酯类、酚类、酸类、聚异 戊烯醇类、甾类、叶蜡等复杂成分, 给银杏DN A的提取带来一定困难。经过一段时间的摸索 并结合其他资料的提取方法发现:在DNA提 取液中添加具有抗氧化和稳定作用的PVP, 浓度以 6% 为宜。并提高提取液中的 β— 巯基乙 醇浓度以排除杂质的干扰, 如此得到的银杏DN A粗提物中黄色物质即明显减少, 因而获得的白 色的总DNA纯度较高。
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2.2 ISSR-PCR 扩增 为了保持酶的活性,缩短扩增时间,提高效 率。 ISSR 反应扩增条件参照葛永奇等的方法 ,并略加以改进。
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2.2.1 反应体系 ISSR 反应总体积为 25μL :模板约 60ng, 1 U Taq 酶, 1.5 m mol/ LM gCl 2, 4 种dNTPs各 0.25 mm ol / L, 0.3μ mol / L引物, 0.5 mmol / L亚精胺, 2% 甲酰胺。 2.2.2 反应条件 预变性 94 ℃ 5 min, 1 个循环 ; 变 性 94 ℃ 1 min,52 ~ 55 ℃复性 45 s,72 ℃ 延伸 2 min,45 个循环 ; 终变性 72 ℃ 5 min, 1 个循环。
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2.3 统计分析 PCR 反应产物用 2.0% 琼脂糖 ( 内含 EB) 电泳,在 紫外检测仪上观察并拍照记录。 最后利用 WINAMOVA1.55 软件进行分析统计 ,位点的命名由所用引物和条带大小来确定。
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3. 分子标记在银杏性别鉴定、遗传变异、系统分类 与进化中的研究进展 目前从国内外发表的文章来看,人们主要对银 杏的性别基因进行标记。王晓梅等 (2001) 应用 RAPD 和 AFLP 技术, 筛选与银杏性别相关的分子标 记, RAPD 标记中应用 150 个 10bp 随机单引物及 110 对随机引物组合, 检测了雌雄基因组 DNA, 获得 1 个与雄性相关的 RAPD 标记。 AFLP 标记应用 48 个引物组合, 检测雌雄银杏基因组 DNA 的多态性, 其中 3 个引物组合各提供了 1 个与雌性相关的分子 标记,经 Southern 点杂交证实有两个标记为银杏 雌性基因组所特有。这些分子标记的获得为寻找 性别特异的探针或 PCR 引物, 用于银杏的性别鉴定 奠定了基础。
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姜凌等也利用 RAPD 技术寻找银杏中与性别 相关的分子标记,得出一条大小为 682bp 、雄性 特异的分子标记。同时,刘叔倩等 (2001) 也用 RAPD 标记方法对 28 个银杏变异类型进行遗传多 样性检测和遗传分析。分析了银杏变异类型的遗 传分化及其遗传多样性水平。
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葛永奇、邱英雄等 (2003) 采用 ISSR 分子标记技术, 对江苏泰兴、美国纽约的栽培银杏群体和中国 3 个可 能为野生的银杏自然群体 ( 浙江西天目山、贵州务川、 湖北大洪山区 ) 的遗传多样性水平和群体遗传结构进 行了研究。用 13 个引物对 5 个群体共 66 个样品进行 扩增, 共得到 88 个清晰的扩增位点, 其中多态性位点 62 个, 多态位点百分率 (PPB) 为 70.45% 。可见从 DNA 分子水平对银杏遗传变异的研究是行之有效的,但 这方面的研究主要集中于研究银杏雌雄基因组间的 差异性及主要栽培雌株的 DNA 分析, 而对银杏雄株的 基因研究尚未见报道。而随着社会发展,银杏雄株 的经济价值凸现,银杏雄株期待着科学的系统分类 和进一步研究。
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4. 展望 DNA 分子标记技术应用于银杏分类研究的时间并不长, 但其在这一领域的成果却是有目共睹的。不过这项技术 尚处于起步探索阶段, 在实际研究中还有一定的局限性。 比如对银杏等一些含有大量多糖如酚、酯、萜等其他二 次代谢产物的植物,要从其组织中提取高质量的基因组 DNA 一般比较困难。还有分子技术反应条件繁杂、严格, 扩增产物稳定性难以控制等, 这都限制了该技术的应用。 但随着植物分子生物学的飞速发展及分子标记技术的逐 步完善, 相信在不久的将来, 会发明创造 D NA多态性高、 重复性好、方法简便、可自动化、共显性及成本低的分 子标记用于银杏的系统学研究及基因组研究中, 为其提供 更清楚的遗传背景. 使这一分子标记极大地对品种进行综 合改造、检测、控制与数量性状有关的等位基因的遗传 和变异, 来推动银杏的分子标记辅助选择育种, 为我国林业 事业的发展发挥重要作用。
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