1. Isolation and Characterization of Azospirillum spp. 90134014 吳昇達 90134094 楊承琳 指導老師 : 趙維良

2. Azospirillum 的菌種特性 1.G(-) 短桿菌，直徑約 1.0μm ，長度約 2~3μm 2. 微量好氧菌 3. 有移動性，具有鞭毛 4. 能進行固氮作用 5. 最適合生長溫度 :35-37 度 6. 在含有有機酸鹽類的培養基能長的很好 如 :malate( 蘋果酸 ) 、 succinate( 琥珀酸 ) 、 pyruvate

3. 7.DNA 的 G+C 百分比約 69-71% 8. 常出現於榖類作物 ( 常出現稻米中 ) 的根部和土 壤中 9. 在 potato agar 上呈現紅色點狀菌落，有皺摺 10. 在 BMS agar 上出現粉紅色、不透明、圓形、 有皺摺的菌落 11. 培養在 nitrogen-free malate media ，微量好 氧情況下會進行固氮作用 12. 在 Congo red medium 會出現鮮紅色菌落

4. Oxidase+ Urease+ Starch- gelatin- indole-

5. 實驗器材 1.Phase-contrast microscopy 2. 稻米田的土壤 ( 包含稻米作物 ) ＊本次採樣地點為北市中正高中後門稻田 3.RC medium 、 BMS medium 、 Nfb tube 4. 各培養基作為生化測試用 (Oxidase 、 Urease 、 Starch 、 gelatin 、 indole)

6. 主要使用培養基成份 1.Nfb medium ( 成份為每公升的需求量 ) a. L-malic acid 5.0g 、 NaCl 0.1g b. K 2 HPO 4 0.5g 、 MgSO 4 ． 7H 2 O 0.2g c. CaCl 2 0.02g d. Trace element solution ： (Na 2 MoO 4 ． 2H 2 O 0.2g 、 MnSO 4 ． H 2 O 0.235g 、 H 3 BO 3 0.28g 、 CuSO 4 ． 5H 2 O 0.008g 、 ZnSO 4 ． 7H 2 O 0.024g 、 distilled water 1000mL) 2.0mL

7. e. Bromthymol blue 2.0mL f. Fe EDTA(1.64% solution) 4.0mL g. Vitamins solution (biotin 0.01g 、 pyridoxin0.02g 、 distilled water 1000ml)1.0ml h. KOH 4.0g 、 1.75g agar ※利用 KOH 調整 pH 值到 6.8

8. 2.RC medium( 成份為每公升的需求量 ) a. K 2 HPO 4 0.5g 、 MgSO 4 ． 7H 2 O 0.2g b. NaCl 0.1g 、 yeast extract 0.5g c. FeCl 3 ． 6H 2 O 0.015g 、 DL-malic acid 5g d. KOH 4.8g 、 agar 20g ※利用 0.1N KOH 調整 pH 值到 7.0 15mL,1:400 aqueous solution (RC)

9. 3.BMS medium( 成份為每公升的需求量 ) a. L-malic acid 2.5g 、 KOH 2.0g b. raw cane sugar 2.5g 、 Vitamins solution (biotin 0.01g 、 pyridoxin 0.02g 、 distilled water 1000mL) 1.0mL c. bromthymol blue 2 drops d. agar 15.0g

10. 實驗步驟

11. 1. 收集稻米作物樣本，以無菌水沖洗 2. 以無菌水沖洗根部，並切下根部約 5-8mm 3. 將根部磨碎加入含有 5mL 的 Nfb medium 試管中 4. 培養 37 ℃ 72 小時 5. 挑出培養基液面下 1-4mm 的白色菌環，利用 phase-contrast 鏡檢，觀察是否有細菌呈桿狀、 細長類似 S 型

12. 6. 將白色菌環菌液連續稀釋到 10 的 4~5 次方，利 用 RC medium 推平板 ，培養 37 ℃ 72 小時 7. 挑選 RC medium 上 紅色 、 點狀菌落，利用 phase-contrast microscopy 鏡檢，挑選出形狀 為陰性桿菌的菌落 8. 將菌落進行連續稀釋，四區劃線培養在 RC medium 上 ， 確保獲得純菌 9. 對菌落進行各種生化測試

13. 採樣地點 北市市立中正高級中學後門農田

14. 結果 ㄧ、稻米根部樣本置入 Nfb tube 中，培養 72 小時， 在試管液面下 1~4mm 出現白色菌環。如圖一

15. 圖一、稻米根部培養於 Nfb 上出現白色菌環 左為對照組

16. 二、菌液連續稀釋到 10 5 ，滴入 0.1mL 菌液於 RC medium 上推平板，得到 5 株菌株，分別再接種 到 RC medium 上以確保獲得純菌，進行鏡檢。 三、五株菌株的敘述如下表ㄧ

17. 編號外觀 Gram ’ s stain 1 點狀，粉紅色，直徑約 0.5mm ，桿狀 G （－） 2 針狀，粉紅色，直徑約 1mm ，球狀 G （＋） 3 針狀，橘色，外圈暈開一圈透明不規則 外緣，直徑約 2mm ，球狀 G （＋） 4 針狀，橘色，直徑約 1mm ，球狀 G（＋）G（＋） 5 點狀中間不規則凸起，粉紅色，直徑約 0.5~1.5mm ，球狀 G（－）G（－） 表一、各菌落的外觀型態及染色結果

18. 四、 1 號菌經鏡檢後觀察為 G （－）短桿菌 ，在 RC medium 上呈現紅色點狀菌落 ，應為 Azospirillum.spp ，如圖二。

19. 圖二、 1 號菌株在 RC medium 上之生長情況

20. 圖三.1 號菌株經 Gram’s stain 後在顯微鏡下的觀察

21. 五、將 1 號菌株接種至 BMS medium 上，呈 現綠色菌落，如圖四。

22. 圖四、 1 號菌株在 BMS medium 上產生綠色菌落

23. 討論 1. 在 Nfb tube 上產生的白色菌環表示可行固氮作 用。 2.RC medium 裡面含有剛果紅，能用來區分 rhizobia 和其他種類微生物。 3. 一般而言 Azospirillum spp. 在 BMS medium 上會 呈現粉紅色或深紅色。

24. 4. 本次實驗所篩選到的 1 號菌株在外觀，型態以及 RC medium 上之生長狀況均符合 Azospirillum 的特徵；但是，在 BMS medium 上，卻出現綠 色菌落與理論不符。

25. 5. 針對此實驗結果，可能因素為： （ 1 ）在 rhizobia 中，有其他菌種的外觀型態和 Azospirillum 相似，導致在判斷上出現錯 誤。 （ 2 ）樣本只侷限於稻米，變異性太小，導致在 數次實驗中所得到的菌相並無太大變化而 無法篩選到 Azospirillum 。 （ 3 ）在培養過程中，好氧的環境對 Azospirillum 造成傷害，導致無法生長。

26. 感謝 1. 本實驗特別感謝北投 賴先生提供稻米作物樣本

27. References 1.Enrique A. Rodríguez Cáceres. 1982. Improved Medium for Isolation of Azospirillum spp. Appl Environ Microbiol. 44(4): 990–991. 2Klingmuller,W. 1985. Azospirillum III. Springer- Verlag, New York