1. The Gs – Linked Receptor GPR3 Maintains Meiotic Arrest in Mammalian Oocytes 在哺乳動物卵母細胞內維持 減數分裂初期停止的 Gs – Linked Receptor GPR3

2. 卵的成長

3. 第一次減數分裂

4. 第二次減數分裂

5. Prophase Arrest 初級卵母細胞在進行排卵作用時卵會停止 在第一次減數分裂的 Prophase 的階段 而本 次的實驗就是探討如何在此階段停止 並懷 疑其停止的原因是由於卵母細胞 細胞膜上 擁有某種受器 (Receptor) 可以接受 周圍細胞 所釋放出來的化學物質 來對卵母細胞進行 停止的調控 初級卵母細胞在進行排卵作用時卵會停止 在第一次減數分裂的 Prophase 的階段 而本 次的實驗就是探討如何在此階段停止 並懷 疑其停止的原因是由於卵母細胞 細胞膜上 擁有某種受器 (Receptor) 可以接受 周圍細胞 所釋放出來的化學物質 來對卵母細胞進行 停止的調控

6. 為何懷疑在卵母細胞膜上 有受器 把位於成熟濾泡內的卵母細胞 ( 已 prophase arrest) 移出 發現卵母細胞會回 復減數分裂 (resume meiosis spontaneously)

7. Prophase 和 Metaphase 在顯微鏡下 觀察的不同 Prophase 核膜沒有破裂 Prophase 核膜沒有破裂 核仁是完整的 核仁是完整的 Metaphase 有染色體濃縮的現象 Metaphase 有染色體濃縮的現象 有紡垂絲的形成 有紡垂絲的形成

8. MetaphaseІ and Metaphase ІІ MetaphaseІ 有 紡垂絲 (spindle) 沒有 極體 (polar body) MetaphaseІ 有 紡垂絲 (spindle) 沒有 極體 (polar body) MetaphaseІІ 有紡垂絲 也有極體 MetaphaseІІ 有紡垂絲 也有極體

9. MetaphaseІІ

10. Metaphase ІІ( 放大 )

11. 要使卵母細胞的減數分裂 prophase arrest 必 須活化在卵母細胞內的訊息分子 要使卵母細胞的減數分裂 prophase arrest 必 須活化在卵母細胞內的訊息分子 而其中又以 Gs protein 最為重要 而其中又以 Gs protein 最為重要

12. Gs protein Gs protein 是一種 G 蛋白 Gs protein 是一種 G 蛋白 所謂的 G 蛋白就是可藉由一連串的蛋白活 化的過程 達成活化具有特殊功能的蛋白質 來進行某種機制的運作 所謂的 G 蛋白就是可藉由一連串的蛋白活 化的過程 達成活化具有特殊功能的蛋白質 來進行某種機制的運作

13. 以下是一般的 G protein 活化的過程

14. Prophase Arrest 的機制

15. Gs protein 具有使卵母細胞進行 Prophase Arrest 的功能 Gs protein 具有使卵母細胞進行 Prophase Arrest 的功能 然而 Gs protein 必須接受其他的蛋白活化 (Receptor) 然而 Gs protein 必須接受其他的蛋白活化 (Receptor) 由以上兩點可推測 在卵母細胞膜上應該有 某種受器可以接受外界的刺激 並活化 Gs protein 由以上兩點可推測 在卵母細胞膜上應該有 某種受器可以接受外界的刺激 並活化 Gs protein

16. 為了辨認出此種 receptor 我們查詢 由 cDNA library 所組成的 EST EST ( expression sequence tag database) 一種 資料庫可以找尋某物種某時期某種細胞有 表現的的 DNA 序列 EST ( expression sequence tag database) 一種 資料庫可以找尋某物種某時期某種細胞有 表現的的 DNA 序列 找尋可以成為 G protein – coupled receptors (GPCRs) 其特徵是 7-transmembrane structure 可以使 G protein 活化 找尋可以成為 G protein – coupled receptors (GPCRs) 其特徵是 7-transmembrane structure 可以使 G protein 活化

17. G protein – coupled receptors

18. 查詢結果 1000 多個哺乳動物基因會產生 1000 多個哺乳動物基因會產生 7-transmembrane protein 其中有 15 個被發現 在卵母細胞的 EST 資料庫 15 個之中有一個叫 Gpr3 receptor 這就是的 主題了 辨認它 (Gpr3) 和 Prophase Arrest 有無 直接的關係 15 個之中有一個叫 Gpr3 receptor 這就是的 主題了 辨認它 (Gpr3) 和 Prophase Arrest 有無 直接的關係

19. The Gs – Linked Receptor GPR3 Maintains Meiotic Arrest in Mammalian Oocytes 在哺乳動物卵母細胞內維持減數分裂初期停止 Gs – Linked Receptor GPR3

20. 接下來 就是要證明 Gpr3 receptor 確實與卵母細胞 的 Prophase Arrest 有關 接下來 就是要證明 Gpr3 receptor 確實與卵母細胞 的 Prophase Arrest 有關

21. 實驗一 Gpr3 RNA 的 1: In situ hybridization 2: RT-PCR In situ hybridization 的對象 : 老鼠的卵巢 In situ hybridization 的對象 : 老鼠的卵巢 發現 Gpr3 RNA 主要出現在卵母細胞內 發現 Gpr3 RNA 主要出現在卵母細胞內

22. In situ hybridization

23. 為了進一步比較 Gpr3 RNA 的濃度 使用了 RT-PCR 的技術 RT-PCR (Reverse transcription polymerase RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) 可利用 RNA 反轉錄成 cDNA 越多的 RNA 反轉錄生成的 cDNA 越多 再利 用特別設計的探針則可比較出不同細胞 RNA 含量的多寡

25. 發現在卵母細胞內的 Gpr3 RNA 的濃度遠高 於周圍的體細胞 發現在卵母細胞內的 Gpr3 RNA 的濃度遠高 於周圍的體細胞 由本實驗可以知道 Gpr3 與卵母細胞有密切 的關係 由本實驗可以知道 Gpr3 與卵母細胞有密切 的關係 實驗一 結果

26. 在接下來的實驗會用到基因缺失鼠 基因缺失鼠 (gene knockout mice) 基因缺失鼠 (gene knockout mice) 利用生物技術的方式 製造具有某一特定基 因缺陷 ( 失去功能 ) 的老鼠 藉由和正常老鼠的 比較來了解此特定基因的功能 利用生物技術的方式 製造具有某一特定基 因缺陷 ( 失去功能 ) 的老鼠 藉由和正常老鼠的 比較來了解此特定基因的功能

27. 實驗二 Gpr3 gene knockout mice 1. 由單一個卵母細胞比較 Gpr3-/- :Gpr3 基因缺失 Gpr3-/- :Gpr3 基因缺失 Gpr3+/+ : Gpr3 正常 Gpr3+/+ : Gpr3 正常 觀察的細胞 : 老鼠的 antral follicle 內的卵母細胞 觀察的細胞 : 老鼠的 antral follicle 內的卵母細胞 辨別卵母細胞是否 有 Prophase Arrest 的情況 辨別卵母細胞是否 有 Prophase Arrest 的情況

28. Gpr3+/+

29. Gpr3+/+ 的卵母細胞內的核膜與 核仁均都相當的完整 由此作者 推論此一卵母細胞應該還停留 在 Prophase 的狀態並沒有繼續 進行減數分裂 Gpr3+/+ 的卵母細胞內的核膜與 核仁均都相當的完整 由此作者 推論此一卵母細胞應該還停留 在 Prophase 的狀態並沒有繼續 進行減數分裂

30. Gpr3-/-

31. Gpr3-/- 放大圖

32. 因為已經可以看到 極體 (polar body) 以及濃縮的染色體 所以 作者判斷它 ( 卵母細胞 ) 已經由 prophase 轉變成 metaphase(ІІ) Prophase Arrest 停止 減速分裂 繼續進行 因為已經可以看到 極體 (polar body) 以及濃縮的染色體 所以 作者判斷它 ( 卵母細胞 ) 已經由 prophase 轉變成 metaphase(ІІ) Prophase Arrest 停止 減速分裂 繼續進行

33. 結論 - 由單一細胞比較 Gpr3+/+ 持續 Prophase arrest Gpr3+/+ 持續 Prophase arrest Gpr3-/- 恢復減數分裂 Gpr3-/- 恢復減數分裂 代表說 Gpr3 基因的表現與否確實對卵母細 胞能否維持 Prophase Arrest 有直接的關係 代表說 Gpr3 基因的表現與否確實對卵母細 胞能否維持 Prophase Arrest 有直接的關係

34. 2-2 由卵巢內的卵母細胞作比較 使用進入青春期前的老鼠 使用進入青春期前的老鼠 觀察老鼠的卵巢內各個時期濾泡內的 卵母細胞 觀察老鼠的卵巢內各個時期濾泡內的 卵母細胞

35. 何為濾泡 ? 就是在卵巢內 圍著卵母 細胞的細胞群 就是在卵巢內 圍著卵母 細胞的細胞群

36. 濾泡成熟過程的各個時期 Pre-antral follicle 直徑 <140 µ m Pre-antral follicle 直徑 <140 µ m Early antral follicle 140 µ m< 直徑 <250 µ m Early antral follicle 140 µ m< 直徑 <250 µ m Antral follicle 直徑 >250 µ m Antral follicle 直徑 >250 µ m

37. 卵巢內各時期濾泡卵母細胞回復減 數分裂比例

38. Gpr3+/+Gpr3-/- 卵巢內 Antral follicle 的卵母細胞回覆 減數分裂的比例 0% 0% 82% 82%

39. 而在 Gpr3-/- 的 82% 中 有 42% 已經在 Metaphase ІІ 有 42% 已經在 Metaphase ІІ

40. MetaphaseІ and Metaphase ІІ MetaphaseІ 有 紡垂絲 (spindle) 沒有 極體 (polar body) MetaphaseІ 有 紡垂絲 (spindle) 沒有 極體 (polar body) MetaphaseІІ 有紡垂絲 也有極體 MetaphaseІІ 有紡垂絲 也有極體

41. 無論是 Gpr3-/- 或 Gpr3+/+ 在 Pre-antral 濾泡內的卵母 細胞都不會回復減數分裂 ( 都是 0%) 無論是 Gpr3-/- 或 Gpr3+/+ 在 Pre-antral 濾泡內的卵母 細胞都不會回復減數分裂 ( 都是 0%)

42. Early antral follicle 從 Pre-antral follicle 到 Antral follicle 中間有一過程 稱作 Early antral 從 Pre-antral follicle 到 Antral follicle 中間有一過程 稱作 Early antral Early Antral 是濾泡腔開使充滿液體的時期 Early Antral 是濾泡腔開使充滿液體的時期 Gpr3-/- 內有 37% 的卵母細胞 開始回復減數分裂 Gpr3-/- 內有 37% 的卵母細胞 開始回復減數分裂 (Metaphase І) 正常卵母細胞開始依賴體細胞和 cAMP 來維持 prophase Arrest 正常卵母細胞開始依賴體細胞和 cAMP 來維持 prophase Arrest

43. 可知 在 Early antral follicle 時期的卵母細胞 開始依賴 Gpr3 receptor 來維持 Prophase Arrest 可知 在 Early antral follicle 時期的卵母細胞 開始依賴 Gpr3 receptor 來維持 Prophase Arrest 由此可知 在這 Early antral follicle 時期 Gpr3 receptor 和 周圍體細胞 存在者某種關係來 調控 Prophase Arrest 由此可知 在這 Early antral follicle 時期 Gpr3 receptor 和 周圍體細胞 存在者某種關係來 調控 Prophase Arrest

44. 卵巢內各時期濾泡卵母細胞回復減數分裂比例

45. 結論 - 由卵巢內的卵母細胞作比較 卵母細胞上的 Gpr3 receptor 與 卵周圍體細胞間存在某種關係 來調控卵的 Prophase Arrest 卵母細胞上的 Gpr3 receptor 與 卵周圍體細胞間存在某種關係 來調控卵的 Prophase Arrest

46. 本次實驗的特殊現象 發生於將卵母細胞移出以確認 Gpr3-/- Antral 以及 Early antral 發生於將卵母細胞移出以確認 Gpr3-/- Antral 以及 Early antral 型態濾泡內的卵母細胞是否有 回復減數分裂

47. 將卵母細胞移出以決定在 antral 以及 early antral 內 的哪一個卵母細胞並沒有回復減數分裂

48. 針對這種現象 作者解釋為 可能是 即使在 Gpr3-/- 內 也還存在著某些 特殊種類 (subgroup) 即使 Gpr3 - receptor 失去功能 也依然可維持一 段時間的 Prophase Arrest 針對這種現象 作者解釋為 可能是 即使在 Gpr3-/- 內 也還存在著某些 特殊種類 (subgroup) 即使 Gpr3 - receptor 失去功能 也依然可維持一 段時間的 Prophase Arrest

49. 下一個實驗會使用到 LH( 促黃體 成熟激素 ) 因此在這裡先介紹 LH 以及 LH 對濾泡和卵母細胞的影 響 下一個實驗會使用到 LH( 促黃體 成熟激素 ) 因此在這裡先介紹 LH 以及 LH 對濾泡和卵母細胞的影 響

50. LH 受到 GnRH 的調控

51. LH 會促進排卵作用

52. 如何會使 Prophase Arrest 的卵母細胞 ( 正常狀態下 ) 由 prophase 變成 Metaphase 此一機制是由腦下垂體所分泌的 luteinizing hormone 所調控 此一機制是由腦下垂體所分泌的 luteinizing hormone 所調控 LH 刺激卵母細胞以及週遭的體細胞 (granulosa cells) LH 刺激卵母細胞以及週遭的體細胞 (granulosa cells) 卵母細胞上有 LH Receptor 受到 LH 刺激後 卵母細胞上有 LH Receptor 受到 LH 刺激後 會激起一連串的活化反應 而使得減數分裂 回復進行

53. LH 對濾泡的影響 使得濾泡內的細胞開始膨大 ( 形成黃體 ) 使得濾泡內的細胞開始膨大 ( 形成黃體 ) 使正常的卵母細胞的 Prophase Arrest 停止 使正常的卵母細胞的 Prophase Arrest 停止 減數分裂開始進行 ( 濃度到達一定程度 )

54. 因為 LH 也會使得 Prophase Arrest 停止 減數分裂繼續進行 所以懷疑 LH 與 Gpr3-/- 的 Prophase Arrest 停止有關 因為 LH 也會使得 Prophase Arrest 停止 減數分裂繼續進行 所以懷疑 LH 與 Gpr3-/- 的 Prophase Arrest 停止有關

55. LH dependant gene 要偵測 LH 是否作用到卵母細胞上 就要對 卵母細胞內的 LH dependant gene 進行偵測 要偵測 LH 是否作用到卵母細胞上 就要對 卵母細胞內的 LH dependant gene 進行偵測 在 LH 到達一定程度時 LH dependant gene 就會被活化 而轉譯出 蛋白質 CSP2 在 LH 到達一定程度時 LH dependant gene 就會被活化 而轉譯出 蛋白質 CSP2 (Chondroitin sulfate proteoglycan 2) 因此只 要 檢驗 CSP2 RNA 的含量就可以知道 LH 是否有作用於卵母細胞 (Chondroitin sulfate proteoglycan 2) 因此只 要 檢驗 CSP2 RNA 的含量就可以知道 LH 是否有作用於卵母細胞

56. 實驗三 LH 對卵母細胞的影響 利用 RT-PCR 技術偵測卵母細胞內的 CSP2 利用 RT-PCR 技術偵測卵母細胞內的 CSP2 RNA 以確定 LH 是否對卵母細胞有影響

57. CSP2 RT-PCR

58. 也有可能是 Gpr3-/- 失去形成黃體的機能 使用 LH receptor agonist 來刺激 receptor 即 可檢驗出 Gpr3-/- 是否失去了形成黃體的機 能 使用 LH receptor agonist 來刺激 receptor 即 可檢驗出 Gpr3-/- 是否失去了形成黃體的機 能 在這裡使用的 agonist 是 human chorionic gonadotropin 簡稱 hCG 在這裡使用的 agonist 是 human chorionic gonadotropin 簡稱 hCG

59. hCG 可以偵測卵母細胞是否失去形成黃體的 機能

60. 對 Gpr3-/- 卵母細胞使用 hCG

61. 結論 由實驗三我們可以知道 LH 並不會影響 由實驗三我們可以知道 LH 並不會影響 Gpr3-/- 的回復減數分裂 也就是說 Gpr3-/- 之所以會回復減數分裂 完 全是由於 Gpr3 這個基因失去作用 卵母細胞 上沒有這 Gpr3 receptor 也就是說 Gpr3-/- 之所以會回復減數分裂 完 全是由於 Gpr3 這個基因失去作用 卵母細胞 上沒有這 Gpr3 receptor

62. 實驗四 Gpr3-/- 卵母細胞的表型反轉 將 Prophase Arrest 的 Gpr3-/- 卵母細胞注射 將 Prophase Arrest 的 Gpr3-/- 卵母細胞注射 Gpr3 RNA 將之放入 Pre-antral 的濾泡中培養 觀察濾泡成長到 Antral 時期後是否會有回 復減數分裂的狀況發生 觀察濾泡成長到 Antral 時期後是否會有回 復減數分裂的狀況發生 若沒有回復則代表 Gpr3 receptor 確實可以 阻止減數分裂的回復 (Prophase Arrest) 若沒有回復則代表 Gpr3 receptor 確實可以 阻止減數分裂的回復 (Prophase Arrest)

63. 加入 Gpr3 RNA 明顯減少回復減數 分裂

64. 結論 原本會回復減數分裂的 Gpr3-/- 的卵母細胞 在注射入 Gpr3 RNA 後 變成不在會復減數 分裂 原本會回復減數分裂的 Gpr3-/- 的卵母細胞 在注射入 Gpr3 RNA 後 變成不在會復減數 分裂 由此可知 Gpr3 receptor 確實可以維持減數 分裂的 Prophase Arrest 由此可知 Gpr3 receptor 確實可以維持減數 分裂的 Prophase Arrest

65. Conclusion 由這四個實驗的結果可以知道 Gpr3 receptor 由這四個實驗的結果可以知道 Gpr3 receptor 是存在於卵母細胞膜上的蛋白 可以接受體 細胞產生的訊息傳遞物質 活化 Gs Protein 再 引起一連串的活化反應 最後使得減數分裂 停止