1. Владимиров Юрий Андреевич
Повреждение мембранных структур как основа патологии клетки

2. Физико-химические основы патологии клетки
Символ веры
Главное в биофизике клетки – биофизика биологических мембран.
Главное в науке о физико-химических основах патологии клетки – роль нарушения структуры и функции мембран в клеточной патологии

3. Некоторые функции биологических мембран в животных клетках
Клетки
Мембраны
Функция
Все клетки
Клеточные (Цито-мембраны)
Активный транспорт ионов K+, Na+, Ca2+, поддержание осмотического равновесия. ,
Связывание гормонов и включение внутриклеточной сигнализации
Большинство клеток
Клеточные
Нервные и мышечные клетки
Клеточные
Генерация потенциалов покоя и действия, распространение потенциала действия
Большинство клеток (кроме эритроцитов)
Внутренняя мембрана митохондрий
Перенос электронов на кислород и синтез АТФ (окислительное фосфорилирование)
Эндоплазмати-ческий ретикулум
Перенос ионов кальция из клеточного сока внутрь везикул
Большинство клеток (кроме эритроцитов)
Клетки зрительного эпителия
Мембраны зрительных дисков
Поглощение квантов света и генерация внутриклеточного сигнала

4. Владимиров Юрий Андреевич
Биоэнергетические функции митохондрий

5. Биоэнергетические функции митохондрий
Две главные биоэнергетические функции митохондрий
Окислительное фосфорилирование
Дыхательная цепь
Хемоосмотическая теория окислительного фосфорилирования
Транспорт ионов
Накопление ионов кальция
Набухание митохондрий

6. Строение митохондрии Наружная мембрана Внутренняя мембрана
Внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для большинства ионов, включая ионы водорода, натрия, калия, хлора. Но она, как и другие биологические мембраны проницаема для воды; поэтому объем митохондрий зависит от концентрации ионов внутри и снаружи. В норме концентрации частиц по обе стороны митохондриальной мембраны равны, при патологии концентрация внутри обычно повышается и митохондрии "набухают", к чему мы ещё вернемся.
Матрикс
Кристы
Участок внутренней мембраны
Митохондрии - это везикулярные структуры, образуемые наружной и внутренней мембранами. Внутренняя мембрана образует складки, или кристы, окружающие матрикс. На складках внутренней мембраны видны грибовидные выросты – это H+-АТФаза, или АТФ-синтаза, о которой будет сказано позже.

7. Запасание энергии в митохондриях (окислительное фосфорилирование)
Субстраты + кислород  продукты окисления
АДФ + H3PO4  АТФ
Наружная мембрана
Внутренняя мембрана
Матрикс
Как же
осуществляется
это сопряжение ?
С 1932 года, когда В. А. Энгельгардт открыл оукислительное фосфорилирование, ученые бьются над тем, каков механизм сопряжения этих двух процессов.
Участок внутренней мембраны

8. Дыхательные комплексы
NAD+ + H+
NADH Q
QH2
2e¯
Внутренняя мембрана II
Матрикс
Межмембранное пространство I
III IV
4H+
2H2O O2 C C e¯
Митохондрии осуществляют важнейшую для клеточной биоэнергетики реакцию: фосфорилирование АДФ с образованием АТФ за счет энергии окисления молекулярным кислородом органических соединений, служащих субстратами окисления. Конечная стадия этого процесса – перенос электронов от восстановленных пиридиннуклеотидов или сукцината на молекулярный кислород осуществляется по системе переносчиков электрона, которая в совокупности называется дыхательной цепью. На рисунке схематически изображена дыхательная цепь.
На рисунке римскими цифрами обозначены дыхательные комплексы, на которые мембраны митохондрий впервые разделил Дэвид Грин. Строчными буквами обозначены цитохромы, остальные сокращения общеприняты в биохимии.
Римскими цифрами обозначены дыхательные комплексы, на которые мембраны митохондрий впервые разделил Дэвид Грин. Строчными буквами обозначены цитохромы, остальные сокращения общеприняты в биохимии.

9. Окислительно-восстановительные потенциалы переносчиков
NAD(P) -0.32
enz FMN -0.3
CoQ +0.04
cyt b +0.07
cyt c
cyt c +0.25
cyt a +0.29
cyt a
O2/HOH +0.82
РОП (В)
0.9
- 0.1
0.4
АТФ
НАД, НАДФ
Ферм ФМН
АТФ
КоQ
цит b
цит c1
цит c
цит a
АТФ
При переносе электронов по дыхательной цепи происходит высвобождение энергии, величина которой (в электрон-вольтах) равна разности стандартных восстановительных потенциалов двух реагирующих ред-окс пар. Эти стандартные потенциалы приведены на рисунке.
На участках с большим перепадом энергии осуществляется синтез АТФ (показано стрелками). Эти участки называются точками сопряжения.
цит a3
O2 /HOH

10. Окислительное фосфорилирование (По Митчеллу)
Цепь переноса электронов
Субстраты O2 + -
Мембрана
Наружная среда
Матрикс H+
АДФ + Фн
ATP
F0F1-АТФаза
Английский биохимик Петер Митчелл сначала предположил, а потом показал, что одновременно с переносом электронов по дыхательной цепи митохондрий в определенных ее звеньях, называемых точками сопряжения, происходит перенос протонов из матрикса в окружающую среду. При этом энергия окислительно-восстановительной реакции дельта E превращается в энергию перенесенных протонов.
При переносе электронов по дыхательной цепи в каждой точке сопряжения происходит перенос протонов через мембрану (один электрон – один протон) из матрикса наружу. Создаваемая разность элетрохимических потенциалов протона (дельта мюH+) служит движущей силой для работы АТФ-синтазы (F0F1-АТФаза). Электродиффузионный перенос протонов из окружаюшей среды в матрикс "проворачивает колесо фермента" и происходит синтез АТФ. H+

11. Пространственное строение H+ATP синтазного комплексаb g
ADP F1 F0 Pi
ATP
H2O
На этом рис унке дана схема строения АТФазы (АТФ-синтазы) митохондрий.
А.Н. Тихонов. СОЖ 1997, 7(20): 10-17

12. Транспорт кальция и фосфата в митохондрии
Ca2+
H3PO4

13. Протон-движущая сила (PMF)
Энергия одного моля иона в данной среде называется электрохимическим потенциалом. Разность электрохимических потенциалов протона между двумя водными фазами внутри и вне митохондрий описывается уравнением:
Где R – газовая постоянная, T – абсолютная температура, [H+]o и [H+]i – концентрации ионов водорода вне и внутри матрикса, соответственно, F – число Фарадея, Dj - разность потенциалов между окружающей средой и матриксом.
Петер Митчелл в качестве единицы энергии использовал электрон-вольты, в результате чего уравнение (1) несколько трансформируется:
PMF =

14. Вклад DpH и Dj в PMF PMF (мВ) = 60 (мВ)  DpH + Dj
Суммарная энергия окислительно-восстановительной реакции, превращенная в разность электрохимических потенциалов ионов водорода, была названа П. Митчеллом протон-движущей силой (PMF - proton motive force), по аналогии с электродвижущей силой в гальванической батарее.
Заменив натуральный логарифм десятичным, легко найти величину протон-движущей силы, зная разность pH (DpH) и разность потенциалов (Dj) между средой и матриксом при комнатной температуре; выраженная в милливольтах она будет равна:
PMF (мВ) = 60 (мВ)  DpH + Dj
В митохондриях основной вклад в эту сумму вносит мембранный потенциал, который в присутствии субстрата и кислорода составляет около мВ.

15. Энергизация митохондрии при переносе электронов
Мембраны митохондрии
Матрикс
Цитоплазма
Переносчик фосфата
Переносчик кальция
Протонная помпа
2H+
2e –
D j
D pH
Наряду с компонентами дыхательной цепи, кот орые служат переносчиками электронов, внутренняя мембрана митохондрий содержит белковые переносчики ионов через мембрану, включая переносчикки кальция и фосфата.
Английский биохимик Петер Митчелл сначала предположил, а потом показал, что одновременно с переносом электронов по дыхательной цепи митохондрий в определенных ее звеньях, называемых точками сопряжения, происходит перенос протонов из матрикса в окружающую среду. При этом энергия окислительно-восстановительной реакции DE превращается в энергию перенесенных протонов.
При наличии субстратов и кислорода до дыхательной цепи митохондрий происходит перенос электронов, который в точках сопряжения сопровождается переносом протонов через мембрану: из матрикса в окружающее пространство. Это приводит к появлению на мембране разности электрохимических потенциалов ионов водорода DmH+ , которая включает в себя концентрационную составляющую (разность концентрации водородных ионов, или разность рН) и электрическую составляющую (разность потенциалов по сторонам мембраны).

16. Перенос Ca2+ в матрикс митохондрий
DpH
Мембраны митохондрии
Матрикс
Цитоплазма
Переносчик кальция
Протонная помпа
2H+
Переносчик фосфата
D j +
Ca2+
В мембране митохондрий имеется переносчик ионов кальция, через который они могут проходить вместе со своим зарядом под действием электрического поля (электрофоретически).
При энергизации митохондрии на мембране создается разность Dj (внутри – минус). Это становится движущей силой для диффузии гидроксильных ионов наружу, но такая диффузия возможна только одновременно с переносом внутрь H2PO4– через переносчик фосфата. Таким образом, при переносе Ca2+ на мембране снижается Dj и возрастает DpH.

17. Перенос фосфата в матрикс митохондрий
Цитоплазма H+
H2O 2
H2PO4¯
HO ¯
Переносчик фосфата
Переносчик кальция
2e ¯
В мембране митохондрий имеется переносчик фосфата, который работает по принципу ионообмена: перенос H2PO4– в одну сторону сопровождается переносом HO– - в противоположную сторону (антипорт). Это означает, что при переносе фосфата в матрикс внутри митохондрий будет повышаться концентрация ионов водорода.
При энергизации митохондрии на мембране создается разность pH (внутри - щелочная среда). Это становится движущей силой для диффузии гидроксильных ионов наружу, но такая диффузия возможна только одновременно с переносом внутрь H2PO4– через переносчик фосфата. Таким образом, при переносе фосфата на мембране снижается DpH и возрастает Dj.
2H+
2H+
Протонная помпа
D j
Мембраны митохондрии
Матрикс
DpH

18. Действие Ca2+ и Pi
Электрохимический потенциал протона
+ Pi
+ Ca2+

19. Дыхание митохондрий в разных функциональных состоянияхO2
субстраты

20. Неполяризующийся электрод
Полярографический метод изучения дыхания митохондрий. Полярографическая ячейка
Платиновый электрод –
Неполяризующийся электрод +
Тефлоновая пробка
Стеклянный стаканчик
Митохондрии в среде:
KCl + фосфат + субстраты + O2
Магнитная мешалка

21. Полярографическая волна
0,45 В
Потенциал на Pt-катоде
Ток в цепи
Много кислорода
Мало кислорода
Реакция на катоде:
Pt - электрод
Водная фаза e¯
O2 → ·OO¯
U = 0,45 В
Концентрация кислорода в среде
Ток в цепи
Калибровочная кривая

22. Потребление кислорода митохондриями в разных состояниях по Б. Чансу
Среда инкубации содержит ортофосфат и немного АДФ
100 мкА О2
1 мин
Время инкубации суспензии без доступа кислорода
Концентрация кислорода V1
Добавили митохондрии V2 V3
Добавили сукцинат V4
Кончилась АДФ
Наклон кривой в каждый момент времени характеризует скорость потребления кислорода (дыхания) в данном состоянии, эти величины принято обозначать как V1, V2, V3, V4 и т.д., где цифрами обозначены состояния по классификации Б. Чанса.
Вприведеном опыте суспензия митохондрий в изотоническом растворе KCl содержала ортофосфат и АДФ, а также растворенный в среде кислород, но не содержала субстратов дыхания (состояние 2, деэнергизованные митохондрии). При добавлении сукцината митохондрии энергично потребляют кислород и происходит синтез АТФ (состояние 3, окислительное фосфорилирование). Если АДФ было немного, оно быстро расходуется, фосфорилирование прекращается и скорость дыхания резко снижается (состояние 4, дыхательный контроль, митохондрии энергизованы, на мембране поддерживается высокая разность потенциалов). Когда в среде кончается кислород, митохондрии перестают дышать и деэнергизуются (состояние 5). Тангенс угла на­клона участков этой ломаной линии представляет собой скорость потребления кислорода в различных состояниях (V2 - V5).
Наиболее информативны V3 – скорость дыхания митохондрий при окислительном фосфорилировании, т. е. в присутствии субстратов окисления, АДФ и ортофосфата, и V4 – скорость дыхания митохондрий в присутствии субстратов окисления и ортофосфата, но в отсутствие АДФ (состояние дыхательного контроля).
Исчерпан кислород V5

23. Состояние 2 - деэнергизованное
Протонная помпа
Переносчик кальция
Переносчик фосфата
АТФ-синтаза + – H+
ADP
ATP
АДФ 1
МИТО 2 3
SUC 4 5
Время
кислород

24. Состояние 3 - Фосфорилирующее
Протонная помпа
Переносчик кальция H+ e¯
Переносчик фосфата H+
ADP
ATP
АДФ 1
МИТО 2 3
SUC 4 5
Время
кислород
АТФ-синтаза

25. Состояние 4 – Энергизованное (Дыхательный контроль)
Протонная помпа
Переносчик кальция H+ e¯ + –
D j DpH
Переносчик фосфата
АДФ 1
МИТО 2 3
SUC 4 5
Время
кислород
АТФ-синтаза

26. Состояние 5 – Анаэробное
Протонная помпа
Переносчик кальция
Переносчик фосфата
АДФ 1
МИТО 2 3
SUC 4 5
Время
кислород
АТФ-синтаза

27. Потребление кислорода митохондриями при транспорте ионов
Среда инкубации содержит ортофосфат и субстраты
100 мкА О2
1 мин
Время инкубации суспензии без доступа кислорода
Концентрация кислорода V1
Добавили митохондрии V4 V6
Добавили CaCl2 V4
Кончился Ca2+
Протонофор Vu V5

28. Состояние 6 – Транспорт ионов
Ca2+
Протонная помпа H+ H+
HPO32– e¯
D j DpH
SUC 1
МИТО 4 6
CaCl2 5
Время
кислород
FCCP U

29. Разобщение фосфорилирования
Протонная помпа
Переносчик кальция H+ e¯
ПРОТОНОФОР
Переносчик фосфата
ADP
ATP
АДФ 1
МИТО 2 6
CaCl2 4 5
Время
кислород
FCCP U H+
АТФ-синтаза

30. Состояние U - Разобщенное
Протонная помпа
Переносчик кальция H+ e¯
Переносчик фосфата
ПРОТОНОФОР
АДФ 1
МИТО 2 6
CaCl2 4 5
Время
кислород
FCCP U H+
АТФ-синтаза

31. Характеристика функциональных состояний
Состояние
Состав среды инкубации
Название состояния
Потенциал на мембране
Состояние переносчиков электрона 2 3 4 5 6 U
Попробуем самостоятельно охарактеризовать функциональные состяния. Что мы о них уже знаем с точки зрения:
Состава среды
Величины потенциала на мембране (высокий он или низкий)
Состояния переносчиков электронов (восстановлены они или окислены)
Можем ли мы дать имя каждому из состояний?
Затем перейдем к следующему слайду, где даны ответы на эти вопросы.

32. Характеристика функциональных состояний
Состояние
Состав среды инкубации
Название
Потенциал на мембране
Состояние переносчиков электрона 2
Pi + ADP
Деэнерги-зованное
Низкий
Окислены 3
Pi + ADP + субстрат
Фосфори-лирующее
< 175 мВ
Промежуточное 4
Pi + субстрат дыхания
Дыхатель-ный контроль
175 мВ
Восстановлены 5
Нет кислорода
Анаэробное
Очень низкий 6
Pi + Ca2+ + субстрат
Транспорт катионов U
Как 3, 4 или 6 + протонофор
Разобщенное

33. Как по скорости дыхания митохондрий в разных состояниях можно судить о месте повреждения?
Состояние
Нарушен перенос электронов
Повреждена мембрана
Нарушен транспорт фосфата
Нарушен АТФ-АДФ обмен 2 3 4 5 6 U
Попробуем сначала самостоятельно оценить влияние перечисленных в первой строке нарушений на скорость дыхания в разных функциональных состояниях. Поставбте стрелку вверх  и
стрелку вниз  там, где скорость падает. Если Вы уверены, что скорость не неняется, поставьте знак –. Остальные ячейки оставьте пустыми.
Затем перейдем к следующему слайду, где даны ответы на эти вопросы.

34. Как по скорости дыхания митохондрий в разных состояниях можно судить о месте повреждения?
Состояние
Нарушен перенос электронов
Повреждена мембрана
Нарушен транспорт фосфата
Нарушен АТФ-АДФ обмен 2 3  4  5 ─ 6 U
Наиболее информативны V3 – скорость дыхания митохондрий при окислительном фосфорилировании, т. е. в присутствии субстратов окисления, АДФ и ортофосфата, и V4 – скорость дыхания митохондрий в присутствии субстратов окисления и ортофосфата, но в отсутствие АДФ (состояние дыхательного контроля).

35. Коэффициент Дыхательного контроля
Среда инкубации содержит ортофосфат и субстрат дыхания
100 мкА О2
1 мин
Время инкубации суспензии без доступа кислорода
Концентрация кислорода
+ митохондрии V1
+ АДФ V4
КДК = V3 / V4
Суспензия митохондрий в изотоническом растворе KCl содержала ортофосфат и АДФ, а также растворенный в среде кислород, но не содержала субстратов дыхания (состояние 2, деэнергизованные митохондрии). При добавлении сукцината митохондрии энергично потребляют кислород и происходит синтез АТФ (состояние 3, окислительное фосфорилирование). Если АДФ было немного, оно быстро расходуется, фосфорилирование прекращается и скорость дыхания резко снижается (состояние 4, дыхательный контроль, митохондрии энергизованы, на мембране поддерживается высокая разность потенциалов). Когда в среде кончается кислород, митохондрии перестают дышать и деэнергизуются (состояние 5). Тангенс угла на­клона участков этой ломаной линии представляет собой скорость потребле­ния кислорода в различных состояниях (V2 - V5). См. также рис. 9.
V3 - фосфорилирование
V4 – дыхательный контроль

36. Изменение свойств митохондрий при гипоксии ткани1 2
3 мин
100
мкат /л 3 4
Митохондрии +
субстрат
АДФ
Изменение свойств митохондрий при гипоксии ткани.
Слева - митохондрии печение крысы выделены сразу после декапитации животного и извлечения печени. Справа – печень выдерживали в анаэробных условиях в течение 30 мин.
Видно одновременное снижение скорости дыхания в фосфорилирующем состоянии (V3)и возрастание в состоянии дыхательного контроля (V4).
Отношение ДК = V3 / V4 (коэффициент дыхательного контроля) также снижается.

37. Повреждение митохондрий почек при аноксии60 70 80 90
100 1 2
400
500
600
700
Дыхательный контроль, %
Са2+-ёмкость, усл. ед.
Время аноксии, часы