1. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B Laboratory aspects of IVM DAL CANTO MARIABEATRICE BIOGENESI REPRODUCTIVE MEDICINE CENTER, ISTITUTI CLINICI ZUCCHI V. Zucchi, 24-Monza (Italy) tel/fax +39.39.8383314

2. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B ANTRAL FOLLICLE 5-12 mm PROPHASE I Cell diameter 110-120 µ m Monolayer cumulus cells Zona pellucida Cytoplasmic maturation Minimum follicular diameter to produce a competent oocytes is around 5 mm Minimum follicular diameter to produce a competent oocytes is around 5 mm PRE-ANTRAL FOLLICLE 2-5 mm PROPHASE I Cell diameter 80 µ m Monolayer cumulus cells

3. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B GVBD 2n cAMP LH FF-MAS MPF cAMP OOCYTES MATURATION PROPHASE I METAPHASE II granulosa cell

4. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY -1 DAY 0 IVF DAY 1-2 I.V.M. I.V.F....IVM REQUIRES FLEXIBILITY AND ADJUSTMENTS...

5. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B TRANSVAGINAL US GUIDANCE CRAFT VACUUM PUMP (pressure 80-90 mmHg) ASPIRATION NEEDLE (Gynetics 4551E  17-G single lumen) SINGLE FLASK TO COLLECT OOCYTES IN VITRO MATURATION Oocytes Collection

6. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B

7. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B

8. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B

9. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY –1 Disposable Material  Filter 0.70 μm  Syringes  Flask or tube  Petri dishes  Flushing Medium with Heparin  Maturation Medium IN VITRO MATURATION Oocytes Collection

10. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY -1 IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B

11. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY -1

12. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY -1

13. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY -1

14. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY - 1

15. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B IN VITRO MATURATION Oocytes Collection

16. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B PICK UP (8.30 am) 3 hrs INCUBATION IN LAG MEDIUM (09.00) 26 hrs INCUBATION IN IVM MEDIUM (12.00 am) DAY –1 r-FSH 0.075 IU/ml hCG 0.10 IU/ml 10% patient’s serum IN VITRO MATURATION Biological Aspects

17. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B EXPANDED CUMULUS FULL CUMULUS SPARSE CUMULUS NUDE IN VITRO MATURATION Oocytes Classification

18. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY -1 EXPANDED CUMULUS Immature oocytes with multilayer and slack cumulus

19. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B FULL CUMULUS Immature oocytes with compact complete cumulus DAY -1 IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B

20. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B SPARSE CUMULUS Immature oocytes with partial cumulus DAY -1 IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B

21. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B NUDE Immature oocytes without cumulus DAY -1 ATRETIC

22. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY 0 Maturation control (3.00 pm)  hyaluronidase 80 UI ICSI (4.00 pm) IN VITRO MATURATION Biological Aspects

23. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY 0

24. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY 1 Fertilization control (8.30 am) Culture in multiwells in ISM-1 Medium IN VITRO MATURATION Biological Aspects

25. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B DAY 2 Embryo control Embryo transfer IN VITRO MATURATION Biological Aspects No cleavage delay was observed

26. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B n°% Cycles started463 Oocytes retrieved Full cumulus Sparse cumulus Nude + Atretic Oocyte in culture 1804 1455 207 142 1662 80.6 11.4 8 Maturation rate Fertilization rate (2PN) 986/1662 671/824 59.3 81.4 RESULTS Natural IVM

27. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B n°% n° Embryos transferred n° Emb. 0% fragmentation n° Emb. 1-10% fragmentation n° Emb. 11-20% fragmentation n° Emb. 21-40% fragmentation n° Emb. >41% fragmentation 671 287 200 78 65 41 42.7 29.8 11.6 9.6 6.3 RESULTS Natural IVM

28. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B 09.03.2004 A new Law regarding ART was approved in Italy...use no more than 3 oocytes for each cycle so as to avoid to produce more than 3 embryos......all embryos obtained must be transferred simultaneously with no selection.... 3 topics... embryo cryopreservation is forbidden....

29. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B n°% N° transfers N° patients N° tot embryos n° embryos/transfer 361 289 671 1.8 ± 0.6 β-hCG positive test Clinical pregnancies PR/transfer PR/patient IR 60 54 54/361 54/289 58/671 14.9 18.6 8.6 RESULTS Natural IVM

30. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B n° Transfers n° Patients n° Clinical Pregnancies PR/transfer (%) PR/patient (%) IVM 1641222515.4 20.5 ICSI 4554077817.1 19.2 FIVET 2432204819.8 23.0 Pregnancy rate with standard IVM, ICSI and IVF-ET in women ≤39 age (May 2004-September 2005) Dal Canto et Al., RBM Online Vol.13, N°2, August 2006 IVM: the first choice in Italy

31. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B RESULTS IN SELECTED WOMEN * *

32. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B RESULTS IN SELECTED WOMEN WITH “TOP QUALITY” EMBRYOS * analysis performed on women <37 years in which only “top embryos” were transferred * *

33. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B we are studing…  New Maturation Medium  Extended Culture up to blastocyst Stage  In-vitro matured oocyte Cryopreservation

34. IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B IOGENESI Centro di Medicina della Riproduzione B Equipe Medica Dr R. Fadini Dr M. Mignini Renzini Dr R. Comi Dr G. Rangoni Dr A. Villa Dr M. Mastrolilli Dr A. Epis Equipe Biologica Dr M.B. Dal Canto Dr F. Brambillasca Dr M. Crippa Dr D. Fumagalli Dr M. Lain Dr. M. Merola Sig.ra M. Majoli Sig.ra A. Longoni Segreteria Sig.ra C. Del Favero; Sig.ra P. Loreto; Sig.ra F. Rapisarda; Sig.ra F. Froio