1. Modulation of aflatoxin B1 production by A. flavus
Carol VERHEECKE
Merci Mr le Président,
Je tiens à vous remercier ainsi que les membres du jury d’être venu aujourd’hui.
Je vais vous présenter mes travaux de thèse qui ont été réalisés au sein du Laboratoire de Génie Chimique, équipe Bioprocédés et Systèmes microbiens située à l’ENSAT. Ce travail a été réalisé sous la direction du Pr. Florence Mathieu et Pr Thierry LIBOZ et s’intitule Modulation de la production d’aflatoxine B1 chez Aspergillus flavus.
Supervisors: Pr. MATHIEU & Pr. LIBOZ
11/25/2014
PhD defence

2. Plan Introduction Objectives Results Conclusion Perspectives
Part 1: Impact of Aw, °C, incubation time on aflatoxins B production
Part 2: Impact of actinomycetes impact on aflatoxins production
Conclusion
Perspectives
Afin de vous présenter mes résultats de thèse, je vais adopter le plan suivant,
Je commencerai d’abord par une Introduction du contexte de la thèse. Il s’en suivra de la présentation des objectifs de thèse. Par la suite, les résultats seront présentés en deux parties précédé chacune par une présentation de la méthodologie employée. Puis je terminerai pas les conclusions principales et les perspectives.
11/25/2014
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3. Aflatoxins (B1, B2, G1, G2, M1) Introduction Zearalenon Ochratoxin A
Mycotoxins:
- are low molecular weight molecules (mostly thermostable);
- are secondary metabolites produced by filamentous fungi;
- can cause death or disease to human being or animal at a low concentration.
Zearalenon
Citrinin
T-2 & HT-2
Aflatoxins (B1, B2, G1, G2, M1)
L’aflatoxine B1 est une mycotoxine. Celles-ci sont des molecules de faible poids moleculaire, produites par des champignons filamenteux et qui peuvent entrainer des symptoms graves chez l’homme et l’animal allant parfois jusqu’à la mort. Parmi les 300 à 400 mycotoxines connues, seule 14 sont normées par l’union européenne, il s’agit de la patuline, les T-2 & H-T2, la Deoxynivalenol, la Zearalenone, les Fumonisines ainsi que l’Ochratoxine A, la citrinine et les Aflatoxines. Ces toxines ont des effets nefastes connu, néanmoins seul les aflatoxins sont avérées cancérigènes pour l’homme. Mes travaux de these se focaliserons sur ces dernières. Pour pouvoir lutter contre la presence de ces toxines dans l’aliment il est important de connaitre les étapes à risque dans la chaine agroalimentaire.
Ochratoxin A
Deoxynivalenol
Fumonisins B1, B2
Patulin
Bennett & Klich (2003)
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4. Introduction Food and Feed Regulations:
Aflatoxin B1: (EU 1881/2006 modified 03/2014)
Food:
Cereals for infants (0.1 µg.kg-1) to humans (2 µg.kg-1)
Feed (≤ 20 µg.kg-1)
Prenons l’example de la concentration en aflatoxines dans la filière maïs. Le champs, le préstockage et le stockage peuvent entrainer une accumulation. Au champs, les ravages causés par les insectes et le stress hydrique de la plante augmentent le risque. Au pré-stockage, trop d’attente et/ou un séchage trop long augmente également le risque. Le process quant-à lui, réduit que partiellement la concentration en aflatoxines.
Afin de limiter la quantité résiduelles retrouvée, l’union européenne a fixée des normes. Par exemple pour l’aflatoxine B1 elle est réglementée dans les céréales pour les bébés à 0.1 µg.kg et l’homme 2. En ce qui concerne l’alimentation animale les normes atteignent jusqu’à 20 µg.kg. Ces normes génèrent des contraintes pour le secteur agro-alimentaire.
11/25/2014
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(Pitt et al., 2013)

5. Introduction In France: Current risk: In the Future ( 2001-2100):
Deoxynivalenol, Fumonisins
In the Future ( ):
+5°C
En France les toxines Deoxynivalenol et Fumonisines, toutes deux principalement produites par des champignons filamenteux du genre Fusarium spp. sont actuellement les plus contraignantes. Néanmoins, les risques d’aflatoxine B1 en France vont apparaitre dans le sud de la France d’ici 100 ans. Ce risque sera d’autant plus élevé si le réchauffement climatique entraine une augmentation de 5°C, alors toute la France sera exposée avec des points sporadiques a haut risque (ici représenté en rouge). Intéressons nous de + prêt à la présentation de ces toxines.
11/25/2014
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(Battilani et al., 2012).

6. Aflatoxins: presentation
Discovered in 1962
Composed of:
Coumarin group
Bisfuran ring
Pentan group
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
Furan group
AFB
De ce fait nous nous sommes concentré sur les aflatoxines. Celles-ci ont été découverte en 1960 à la suite de la mort de 100aine de milliers de dindons en Angleterre. L’enquète a permis leurs découverte. Les aflatoxines B sont constituées d’un groupe coumarine centrale (ici en rouge) et d’un anneau bisfurane (ici en vert). L’AFB1 possédant cette double liaison alors que l’Aflatoxine B2 non. Et enfin d’un groupe pentan. Les aflatoxines G quant a elle ont un groupe furan qui remplace le pentan des B.
AFG
2D structures of aflatoxin B1 (AFB1), aflatoxin B2 (AFB2),
aflatoxin G1 (AFG1) and aflatoxin G2 (AFG2)
11/25/2014
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7. Aflatoxins: toxicity HepatoCellular Carcinoma:
If Hepatitis B:
7 to 10.6
- Child growth retardation:
- 1.7 cm (8 months)
- Immune System:
Reduction in immune system differentiation
- Still born and jaunice
Concernant leurs toxicité. En cas d’exposition aïgue, elles sont mortelle. En cas d’exposition chronique, elles sont cancérigène pour l’homme, et se sont les seules mycotoxines classées groupe 1 par l’IARC. Le cancer engendré est un carcinome hépatocellulaire, d’autant plus pour les porteurs d’hepatite B. En plus des risques hepatotoxiques, d’autres effets existent. Par exemple, une reduction de la différenciation des cellules du système immunitaire, un retard de la croissance chez l’enfant et une augmentation des morts-né et des jaunices chez le nouveau-né. Afin de pouvoir eviter ces effets nefaste sur l’homme et l’animal il est necessaire de comprendre qui produit les aflatoxines et dans quelles conditions.
11/25/2014
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(Ross et al., 1992; Jiang et al., 2005; Gong et al., 2004; Shuaib et al., 2010)

8. Aflatoxins: producersh cd v p c
5 µm
A. mottae
Aspergillus flavus by microscopy. c= conidies; cd= conodiophores; h= hyphae; p= phialides and v= vesicule. (Personal data)
Celles-ci sont principalement produites par les moisissures du genre Aspergillus. Parmi celles-ci certaines produisent seulement les B et d’autres les B et G (soulignées ici). Parmi ceux-ci, A. parasiticus est traditionnellement utilisé comme représentant des producteurs d’aflatoxines B et G. Quant-à, A. flavus, représenté ici, c’est le producteur principal retrouvé dans de nombreuses denrées alimentaires. Cette production est dépendante de paramètres environnementaux biotiques et abiotiques.
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9. Aflatoxins: abiotic parameters
Growth
Water activity: aw
Temperature °C
AFB1 production °C
Concernant les paramètres abiotiques, Les conditions optimales pour la croissance fongiques ne sont pas les mêmes que celles de la production. Ainsi, si nous regardons l’impact de l’activité de l’eau sur la croissance, l’optimum est une aw comprise entre 0.94 et 0.99 alors que celle d’AFB1 est plutôt comprise entre 0.96 et Pour la température, la croissance optimale est comprise entre 30 et 35 alors que la production d’AFB1 est comprise entre 25 et 30°C. Ces facteurs sont les principaux, néanmoins d’autres facteurs abiotiques comme, la composition atmosphérique et du milieu, le pH, la lumière et l’ajout de composés chimiques ont un impact également.
Other parameters:
Gas composition, Medium, pH, Light, Chemical compounds
11/25/2014
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10. Aflatoxins: biotic parameters
Fungal interaction:
afla-safe®
Fusarium sp.
Bacterial interaction:
Non growth inhibiting bacteria
Maize susceptibility
(IITA, WMF2012)
En ce qui concerne les paramètres biotiques. Les trois principaux sont l’interaction fongique, l’interaction bactérienne, et la prédisposition du maïs. Par exemple, afla-safe est un biocontrol commercialisé contre l’aflatoxine, celui-ci est basé sur des souches d’A. flavus ou A. parasiticus non productrices qui vont rentrer en compétition avec les souches endogènes aflatoxinogènes. Ces biocontrol sont dépourvu d’un ou plusieurs gènes de la voie de biosynthèse,
11/25/2014
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11. Aflatoxins: Biosynthesis
1 AcetylCOA & 9 MalonylCOA
Norsolorinic Acid (NOR)
Versicolorin B
Sterigmatocystin
AFB1 1 2
Les 29 gènes qui codent pour cette voie de biosynthèse sont regroupé dans un cluster. La voie de biosynthèse commence par l’ajout de 9 MalonylCoA à un AcetylCoA. Suite à plusieurs reactions biochimique illustrée dans la thèse, le premier précurseur stable de cette voie de biosynthèse l’acide Norsolorinique est produit. Par la suite, la Versicolorine B est le dernier précurseur avant la séparation des deux voies. La voie 1 est à l’origine de la formation de la mycotoxine sterigmatocystine et également de l’aflatoxine B1. En ce qui concerne la deuxième voie, elle est à l’origine de la production de l’aflatoxine B2. Les producteurs d’aflatoxines G, notamment A. parasiticus possèdent, l’intégralité du gène aflU qui code pour l’oxydase responsable de la conversion en aflatoxines G1 et G2. Cette voie de biosynthèse est régulée par divers mechanismes.
AflU
(NadA, AflF)
(Yu et al., 2004)
AFG1
AFG2
AFB2
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12. Aflatoxins: Regulation
AflR and AflS: specific regulators
( )
AflR:
Zinc Finger transcription factor
Specific binding
5’- WCGSNNNSCGA-3’
(W: A ou T, S: C ou G, R: A ou G)
AflR et AflS sont 2 régulateurs spécifique de la voie de biosynthèse. Les gènes codant pour ceux-ci sont situé également dans le cluster. AflR est un facteur de transcription en doigt de Zinc qui se fixe sur une séquence d’ADN spécifique. AflS est notamment supposé etre un coctivateur d’AflR. D’autres régulateurs interviennent et impactent la voie de biosynthèse par le biai ou non d’AflR/AflS. Les voies de transduction issue de la réponse aux stimuli tel que le pH, le potentiel redox, la lumière ou la température sont partiellement connu. Par exemple, la lumière inhibe la formation du complexe Velvet et ceci empèche son action promotrice sur la biosynthèse d’aflatoxines.
Ainsi, les dernières diapositives ont pu illustrer les différents mécanismes pouvant réprimer la production d’aflatoxines. Néanmoins, dans le cas d’une production résiduelle, des méthodologies de réduction existent.
AflS: AflR coactivator?
11/25/2014
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(Alkhayyat & Yu, 2014)

13. Aflatoxins: reduction
Illumination Fiber
Reflectance Fiber
Physical and chemical methods
Adsorbents
Biological reduction:
Binding
Degradation
Maize kernel
Fiber Optic to Spectrometer
Fiber Optic from Light Source
(Pearson et al., 2004)
Il peut sagir de méthodologies physiques ou chimiques, de l’ajout d’adsorbents ou l’ajout de micro-organismes tel que des bactéries capable de réduire par fixation ou dégradation. Par exemple Mycofix, un adsorbent minéral basé sur la bentonite a été en 2013 contre l’intoxication en aflatoxines chez l’animal.
En bilan, il y a des approches préventives et curatives qui possèdent chacune leurs avantages et leurs inconvénients. Notre objectif ce focalise sur le premier type d’approche.
(= Bentonite, Biomin.net)
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14. Aflafree project
Aflatoxin B1 (AFB1) risk management for a sustainable maize Food chain
WP1: Modelisation of A. flavus growth and AFB1 production
WP2: AFB1 inhibition strategy
WP4: Impact on the maize chain
and good practices
WP3: Characterisation
in greenhouse
Ainsi nous avons écrit le projet Aflafree dont le but est de développer un système de gestion du risque aflatoxines pour une filière maïs durable. Ce projet qui a été financé par l’agence nationale de la recherche française est divisé en 5 groupes de travail. Au sein du laboratoire, nous nous sommes focalisés sur les deux premiers workpackages que sont: d’une part l’étude de la croissance et de la production d’aflatoxine B1 en réponse aux paramètres environnementaux. D’autre part, la mise en place de stratégie d’inhibition contre les aflatoxines.
WP5: Maize chain sustainability increase
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15. Objectives
1) Monitoring A. flavus entry into the French maize ecosystem (e. g. Fusarium sp.) and its impact on aflatoxins and Deoxynivalenol (DON) risks at prestorage.
2) Development of a biocontrol (based on actinomycetes) able to reduce (in interaction with Aspergillus sp.) AFT (AFB + AFG) contamination at field without impacting the maize microbial ecosystem
Ainsi ma thèse se divise en deux objectifs distincts. D’une part suivre l’implantation d’A. flavus dans le maïs en France en considérant son écosystème microbien. D’autre part, le développement d’un biocontrol à base d’actinomycètes capable de réduire la production d’aflatoxines en interaction avec les Aspergillus.
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16. Aspergillus flavus & aflatoxins production
Objectives 1: Context
1) Monitoring A. flavus entry into the French maize ecosystem (e. g. Fusarium sp.) and its impact on aflatoxins and DON risks at prestorage.
Fusarium graminearum (Deoxynivalenol)
Impact ?
Mycotoxins:
Maize rejection
Aspergillus flavus & aflatoxins production
En France actuellement, le maïs est souvent contaminé par Fusarium graminearum responsable de la production de DON. Dans les dizaines d’années à venir, la France aura également un risque accrue d’aflatoxines. De ce fait nous souhaitons étudié l’impact de l’insertion d’A. flavus sur le maïs en France notamment à l’étape critique de pré-stockage où son arrivée pourrai modifier les bonnes pratiques de gestion des organismes stockeurs. Pour commencer les premières études nous nous sommes placés in vitro sur un milieu à base de maïs.
Prestorage
(10-40°C; aw of )
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17. Objectives 2: Context
Aim: identification of a bacterial biocontrol able to grow with A. flavus and reduce AFT accumulation in maize.
Reduction of AFT concentration by the biocontrol (ultimate aim in planta)
Have the least impact on the maize microbial ecosystem
Biocontrol harmlessness
Biocontrol survival in maize or in maize soil.
De ce fait, nous souhaitons que ce biocontrole remplisse certains critères. Notamment que ce biocontrol permette la reduction de la concentration en aflatoxines en boite de Pétri avec comme but final sur le maïs. Nous souhaitons également que ce biocontrol modifie le moins possible l’ecosystème microbien du maïs. Celui-ci doit également être sans danger et potentiellement survive dans/sur le maïs ou dans le sol.
Pour commencer nous nous sommes principalement focalisé sur les deux premiers paramètres.
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18. Why actinomycetes?
class of filamentous, soil born, Gram positive bacteria
major source of secondary metabolites useful for the pharmaceutical and agricultural industries
Actinomycetes are potential biocontrol agents
On maize:
Streptomyces spp. DAUFPE & (Bressan and Figueiredo 2008)
Endophytic Actinobacteria (Costa et al. 2013)
Actinobacteria
(ISP2 medium)
Maize in greenhouse
(Daniel Caron)
Pour cela nous avons choisi les actinomycètes? Ces bactéries filamenteuses sont originaire du sol et sont gram positives. Nous possédons une grande collection de ces bactéries en association avec l’ENS de Kouba. Ces bactéries sont connues pour être une grande source de métabolites secondaire utile pour les secteurs pharmaceutiques et agronomique. Les actinomycetes ont également été étudiées récemment comme potentielle biocontrol notament contre la fusariose du maïs et on été identifiée comme endophytes de cette plante. Ainsi nous avons pioché dans notre collection….
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19. Screening actinomycetes isolates
Methodology:
Screening actinomycetes isolates
Et nous avons mis en place une méthodologie de criblage afin de sélectionner les souches les plus prometteuses. Pour cela nous avons inoculé le même jour un spot d’A. flavus à 106 spores.ml-1 et les isolats actinomycetes en ligne à l’opposé de la boite. Après 10 jours à 28°C, nous avons récupéré les carottes pour le dosage de l’aflatoxine dans cette région et nous avons mesuré la croissance fongique et bactérienne par rapport au control. A la suite de ce screening, une partie des souches sélectionnées ont étudier pour essayer de comprendre leurs mode d’action. Deux approches ont été ciblées, une approche préventive, qui permet de limiter la production et une approche curative qui permet d’envisager la réduction de l’aflatoxine déjà produite.
Verheecke et al., 2014
11/25/2014
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20. Prevention methodology
aflD, aflM, aflP:
AflD: (ketoreductase)
Norsolorinic acid
AflM: (deoxygenase)
Versicolorin A
AflP: (O-methyltransferase)
Sterigmatocystin
O-methylsterigmatocystin
Averantin
Demethylsterigmatocystin
Concernant l’approche préventive, nous avons decider d’étudier certains gènes de la voie de biosynthèse. Parmi ceux-ci, aflD, aflM et aflP codent pour des enzymes spécifiques. AflD est une ketoreductase qui est à l’origine de la conversion du premier précurseur stable en averantine. AflM est une deoxygenase qui converti la versicolorine A en demethylsterigmatocystin, le dernier précurseur avant la mycotoxine Sterigmatocystine. AflP converti celle-ci en methylsterigmatocystin grâce à son activité d’O-methyltransferase. Ces gènes ainsi qu’aflR et aflS codant pour des régulateurs ont été choisi pour étudier l’impact de l’interaction sur l’expression de ces gènes.
(Yu et al., 2004)
aflR and aflS: encode regulators
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21. Prevention methodology
RT-qPCR analysis to monitor
Aflatoxin biosynthesis gene expression
Gene of reference:
identified thanks to geNorm
Gene of interest:
aflD, aflM afP: ‘structural’ genes
aflR, aflS: ‘regulator’ genes
A. flavus & A. parasiticus
la RT-qPCR a été utilisée, celle-ci consiste à étudier l’expression des gènes à un temps donnée et une condition précise.
Pour cela nous avons coinoculé les Aspergillus et les actinomycètes avec une méthodologie proche du criblage. Les modifications apportées furent un film à confiture pour pouvoir récupérer la galette mycelienne, l’ajout d’une ligne supplémentaire d’isolat bactérien, et un rapprochement entre ces lignes et l’inoculum central d’Aspergillus. Pour pouvoir étudier l’expression des gènes d ‘intérêt nous avons choisi nos gènes de références grâce au logiciel geNorm. Cette étude a été réalisée sur deux producteurs différents, A. flavus et A. parasiticus. D’autre part, nous avons étudié si les souches d’actinomycètes sont capable d’agir sur l’aflatoxine déjà produite.
from Yu et al. 2004
11/25/2014
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22. Curative methodology: reduction of AFB1 concentration
ISP2 media supplemented with pure-AFB1 (5 mg.l-1)
Adsorption test
AFB1: 1 µg.ml-1
Spores suspension:
107 spores.ml-1
Incubation
at 28°C for 4 days
1 to 60 minutes 30°C
filtration
HPLC (1)
Pour cela des tests des capacités curatives des souches ont été réalisés. Ainsi, le milieu ISP2 a été supplémenté avec de l’aflatoxine B1 pure à une concentration de 5 mg.l-1 . Après 4 jours d’incubation à 28°C, l’extraction d’aflatoxine B1 est réalisée celle-ci est quantifiée par HPLC couplée à une coring cell. Pour deux souches d’actinomycetes nous avons testé également leurs capacité à adsorber l’aflatoxine B1. Pour cela nous les avons mis en presence d’une concentration de 1mg.l-1 d’aflatoxine B1 et regarder le pourcentage d’aflatoxine récupéré après incubation, lavage à l’eau et au methanol.
Water wash
HPLC (2)
AFB1 methanol Extraction & Quantification coupled with Coring Cell® by HPLC
Methanol wash
HPLC (3)
11/25/2014
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23. Perspectives (Objective 1)
Study of additional factors:
Mycotoxin analysis of the coinoculation tests
Fusarium verticillioides & fumonisins production
Transfer to maize grain:
test critical aw, temperature, time and CO2 content
data compilation to develop models of mycotoxins risk management
Transfer to prestorage:
in vivo tests
software development
Les perspectives à cours terme de l’objectif 1 est l’analyse des résultats de coinoculation. Ainsi que l’étude de l’interaction avec fusarium verticillioides et sa production en fumonisines. Par la suite l’étude des effets de l’aw, des temperatures, du temps d’incubation et de la concentration en co2 critique sur maïs sera nécessaire et sera synchronisée par une compilation des données pour modélisation des risques en mycotoxines. A long terme, des tests in vivo c’est-à-dire dans le préstockage lui-même seront envisagés et une software de gestion du risque sera proposé aux organismes stockeurs.
11/25/2014
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24. Perspectives (Objective 2)
Mechanisms characterisation:
Adsorption tests on the other strains
Kinetic on gene expression study (e.g. S35, S38)
Metabolites identification
Prevent production: VOC? Aflatoxins repressors? …
Reduce concentration: enzyme identification? Degradation products? …
Transcriptome and metabolome studies
En ce qui concerne le deuxième objectif il serait interessant de comprendre les mécanismes impliqués dans les résultats obtenu, pour cela des tests d’adsorption doivent être réalisés sur les autres souches étudiées. Il serait également intéressant de confirmer les données sur l’impact de S35 et S38 notamment en réalisant une cinétique de l’impact sur les gènes.
Dans un deuxième temps il serait interessant d’identifier les métabolites impliqués d’une par dans la prévention : COV? Represseurs connus d’aflatoxine… et d’autre part, dans les solutions curatives: identification des enzymes curatives et identification des produits de degradation? Enfin l’étude des transcriptomes et metabolomes serait nécessaire pour comprendre les mécanismes.
11/25/2014
PhD defence

25. Perspectives (Objective 2)
on maize:
- biocontrol production in various scales
- Test against other mycotoxins producers (e.g. Fusarium sp.)
- test in vitro and under greenhouse
At field:
- biocontrol dispersal (biocontrol characterisation)
- formulation
- harmlessness validation
- accreditation
En ce qui concerne les perspectives d’application des biocontroles. Les prochains tests doivent être réalisés sur le maïs pour cela il sera nécessaire de produire les biocontrole à différentes échelles de l’erlenmeyer au fermenteur. Il sera également nécessaire de tester le biocontrôle contre d’autres producteurs de mycotoxines notaments les Fusariums sp.. Enfin des essais in vitro sur maïs et en serre devrons être réalisés.
A long terme, pour une application au champs, il faudra mettre au point un outil de suivi de la dispersion du biocontrol ainsi que optimiser sa formulation. Des tests d’inocuité devrons être réalisés et les tests d’efficacité auchamps devront être réalisées avant d’envisagée une homologation possible du biocontrole.
11/25/2014
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