1. استرليزاسيون وكنترل كيفي فور واتوكلاو
كارگاه منطقه اي بازآموزي روشهاي آزمون باكتريولوژيك آب وفاضلاب معاونت بهداشتي تبريز
20-19 آبان 1392
پروين بيناي مطلق
كارشناس ارشد مركزسلامت محيط وكار

2. استرليزاسيون تعريف استر ليزاسيون
استرليزاسيون عبارت است از نابود كردن كليه ميكروارگانيسم هاي بيماري زاو غير بيماري زاي موجود در يك محيط اعم از باكتري هاي مولد اسپور ، فاقد اسپور، انواع ويروسها ، قارچ ها وپروتوزوئر ها ،

3. انواع استر ليزاسيون روش هاي مختلفي براي استر ليزاسيون وجود دارد:
استرليزاسيون بوسيله حرارت مرطوب(بخار آب):اتوكلاو
استرليزاسيون بوسيله حرارت خشك( گرماي خشك):آون
استرليزاسيون شامل استفاده از گازها،بعضي از گازهاقادر به تخريب آنزيم ها وساختمان بيوشيميايي باكتريها هستند: ماننداتيلن اكسايد
استرليزاسيون بااستفاده ازپرتوها مانند: اشعه گاما واشعه ماوراي بنفش وساير روشهاي ديگر

4. اتوكلاو
استرليزاسيون بوسيله حرارت مرطوب(بخار آب):اتوكلاو
اتوكلاو بهترين وسيله براي استريليزاسيون مواد ويا تركيباتي است مانند محيط هاي كشت،كه نبايد آبشان را از دست بدهند
محيط دستگاه از بخار آب بايد اشباع باشدچون اگر بخار آب با هوا مخلوط با شدوجود هوا مانع از نفوذ بخار به داخل مواد مي شود واسترليزاسيون ناقص انجام مي شود.
محيط هاي كشت پس از تهيه بايد حد اكثر در عرض 2 ساعت استريل شوند وهرگز نبايد آنها را بدون استر ليزاسيون نگهداري نمود.

5. ادامه...
جهت استريل كردن با اتو كلاو دستگاه را در درجه حرارت 121 درجه سانتيگراد ، 15 اتمسفر فشارتنظيم و به مدت 15 دقيقه (البته پس از اينكه دماي اتو كلاو به 121در جه سانتيگراد رسيد )محيط هاي كشت را استريل مي نماييم.
دماي استريليزاسيون به دماي اتاقك اتوكلاو برمي گردد نه به دماي محيط كشت زمان لازم براي رسيدن به اين دما بايد در حد ممكن كوتاه باشد.
محيط هاي كشت در داخل اتو كلاو بايد به نحوي قرار گيرند كه جريان بخار در داخل آنها به خوبي جريان داشته باشد .

6. براي استريليزاسيون محيط هاي كشت بهتر است از لوله و ارلن هاي درپيچ دار استفاده شود. بيشتر از 2/3 آنها را پر نكنيد. درپيچ آنها را شل ببنديد
از قرار دادن وسايل بر روي يكديگر بپرهيزيد. بايد فاصله آنها از يكديگر و از ديواره هاي اتوكلاو حداقل 5 سانتي متر باشد تا بخار آب ميان آنها جريان يابد.
به منظور صحت عمل استر ليزاسيون لازم است كه با تست هاي مختلف عمل استريل شدن را كنترل نمود.

7. ادامه...
در نگهداري اتوكلاو بايد دقت زيادي نمود .صفحه كف اتوكلاو را بايد روزانه تميز نمود.
آبگذر ودرزها را بايد بطور هفتگي تميز نمود ،سوپاپ اطمينان رابايد بطور مرتب بررسي كرد واز عملكرد وسالم بودن آن اطمينان حاصل نمود.
از آب مقطر هميشه استفاده شود وماهانه آب آنرا تعويض نماييد
هر6 ماه دستگاه توسط كارشناسان ذيربط سرويس وبازرسي شود.
هنگام كار با اتوكلاو بايدكليه مسائل ايمني را رعايت نمود.

8. كنترل كيفي اتو كلاو تست شيميايي: تست بيولوژيك:
آزمايش هاي دوره اي كنترل دستگاه اتوكلاو شامل تست هاي شيميايي وبيولوژيكي به شرح زير مي باشد.
تست شيميايي:
نوار كاغذي (Time,Steam.Tempreture) TST : سه عامل زمان، بخار و دما را كنترل مي كند ودر صورت نفوذ موثر بخارواستر ليزاسيون كامل رنگ روي نوار كاغذي تغيير رنگ مي دهد. در هر ران كاري از اين نوار استفاده كنيد.
تست بيولوژيك:
استفاده ازويال(كپسول)حاوي اسپور Stearothermophilus Geobacillus باسيلوس استئاروترموفيلوس جهت کنترل بيولوژيک اتوکلاوكه به طور هفتگي توصيه مي شود.تعداد استفاده ازويال يا كپسول بستگي به حجم دستگاه دارد.

9. ادامه...
پس از پايان سيكل، ويال انديكاتور بيولوژيك را بيرون بياوريد و طي مدت 2 ساعت آمپول شيشه اي داخل آن را بشكنيد تا محيط كشت و انديكاتور pH داخل آمپول شيشه اي با كاغذ آغشته به اسپور باسيلوس در تماس قرار گيرد، سپس ويال را به مدت 72-24ساعت در دماي 1 ± ˚C 56 انكوبه نماييد و تغيير رنگ در آن را بررسي كنيد.
در صورت تغييررنگ مايع داخل هر يك از كپسول ها مجموعه مردود شناخته شده
عدم تغيير رنگ ( ثابت ماندن رنگ لوله)بيانگر از بين رفتن كليه اسپورها مي باشد.

10. ادامه...
تغيير رنگ محيط كشت از بنفش به زرد، نشانگر رشد باكتريايي و تغيير pH محيط كشت و عدم صحت عملكرد دستگاه است و عدم تغيير رنگ، نشان دهنده از بين رفتن باسيلوس و صحت عملكرد دستگاه است. نتيجه را ثبت كنيد.

11. كنترل مثبت: براي بررسي زنده بودن ميكروارگانيسم داخل ويال هر چند وقت يكبار از كنترل مثبت طبق روش زير استفاده كنيد.
ابتدا يك ويال انديكاتور بيولوژيك را بدون آن كه اتوكلاو شود، به همراه ساير ويال هاي بيولوژيك كه از اتوكلاو خارج كرده ايد، بشكنيد و به مدت ساعت در دماي 1 ± ˚C 56 انكوبه نماييد. باسيلوس موجود در اين ويال حتما" بايد رشد كند و رنگ محيط كشت را زرد نمايد. اگر تغيير رنگ در اين ويال از بنفش به زرد ايجاد شود، نتايج ساير ويال ها قابل اعتماد است. اگر اين ويال تغيير رنگ ندهد، نشان دهنده از بين رفتن خودبخودي باسيلوس است، بنابراين نتايج ساير ويال ها نيز قابل اعتماد نيست.

12. زمان ودرجه حرارت براي استرليزاسيون با اتوكلاو
زمان در 121 درجه سانتيگراد
مواد
10 دقيقه
مامبران فيلتر وپدها
15 دقيقه
محيط كشت براث
30 دقيقه
موادآلوده ومحيط هايي كه بايد دور ريخته شوند
بطريهاي نمونه برداري
محلول هاي بافر رقيق كننده

13. فور
استريليزاسيون بوسيله حرارت خشك
فور(آون) براي استريل كردن موادي كه مقاوم در مقابل حرارت هاي بالا هستند مناسب است ، بويژه براي استريل كردن ظروف شيشه اي مثل لوله آزمايش، پتري ديش، پي پت، وسايل فلزي مواد خشك، روغن ها وچربي هاكار برد دارد.

14. ادامه...
جهت استريل نمودن وسايل فلزي و شيشه اي در اون (فور)، براي بسته بندي آنها، مي توان از فويل آلومينيومي يا كاغذ گراف استفاده نمود
دقت شود كه كاغذ و پنبه نسوزند، چون پنبه نيم سوز مواد باكتري کش فراري را متصاعد مي كند.
حدود 2 سانتي متر از انتهاي فوقاني پي پت ها را با پنبه غيرجاذب ببنديد و آنها را در ظروف فلزي قرار داده، درب آنها را ببنديد.

15. ادامه...
پودر، روغن، چربي ها را در ظروف شيشه اي يا فلزي در بسته و در اندازه هاي كوچك كه از وزن 10 گرم يا عمق كمتر از يك سانتي متر تجاوز نكند، استريل نماييد.
قبل از قرار دادن ظروف شيشه اي در اون، با يد آنها را شسته ، آبكشي و خشك نمود.سپس وسايل را داخل اون قرار دهيد، آنگاه دستگاه را روشن نماييد. مواد را به گونه اي در اون قرار دهيد كه هواي داغ در اطراف و بين آنها در جريان باشد.

16. زمان نگهداري استريليزاسيون از زماني آغاز مي شود كه دماي داخل فور به دماي استريل شدن انتخابي برسد و نيز مدتي هم بيشتر درنظر گرفته مي شود تا همه قسمت هاي اتاقك و مواد داخل آن به دماي مورد نظر برسند.
پس از اتمام استر ليزاسيون نبايد بلافاصله درب اون را باز نماييد، زيرا اگر هواي سرد به طور ناگهاني وارد دستگاه شود ممكن است ظروف شيشه اي ترك بخورند.
هنگام استفاده از فور بايد رعايت مسائل ايمني را نموده واز دستكش هاي مقاوم به حرارت استفاده نمود.
داخل فور بايد مرتب تميز شود.و 6 ماه يكبار توسط كار شناسان سرويس تجهيزات، مورد سرويس وبازرسي قرار گيرد

17. كنترل كيفي فور
آزمايش هاي دوره اي كنترل دستگاه فورشامل تست هاي شيميايي وبيولوژيكي به شرح زير مي باشد.
تست شيميايي: استفاده از آمپول شيشه اي حاوي انديكاتور pH و مشاهده تغيير رنگ مناسب از قرمز به سبز. از اين آمپول در هر ران كاري استفاده كنيد.
تست بيولوژيك: استفاده از نوار كاغذي حاوي اسپور Bacillus atrophaeus
جهت کنترل بيولوژيک فور كه به صورت هفتگي توصيه مي شود.

18. پس از پايان سيكل استر ليزاسيون ،پاكت نوار كاغذي انديكاتور بيولوژيك را از داخل اون بيرون بياوريد و طي مدت 2 ساعت نوار انديكاتور را در كنار شعله با پنس استريل (شرايط آسپتيك) خارج نماييد و در داخل لوله حاوي محيط كشت تريپتيك سوي براث (TSB) يا سوي بين كازئين دايجست براث تلقيح كنيد. لوله را حداقل به مدت 48 ساعت در دماي 1 ± ˚C36 انكوبه نماييد.
لوله محيط كشت را هر روز از نظر ايجاد كدورت كه علامت رشد باكتريايي است، بررسي نماييد. مشاهده هرگونه رشد بايد از نظر وجود اين باسيلوس بررسي گردد، بنابراين بايد آن را بر روي محيط هاي كشت مناسب، كشت مجدد داد. نتيجه را ثبت كنيد.

19. كنترل مثبت: براي بررسي زنده بودن ميكروارگانيسم هرچند وقت يكباراز روش كنترل مثبت طبق روش زير استفاده كنيد.
براي اين كار يك نوار كاغذي انديكاتور بيولوژيك را بدون آن كه در داخل فور قرار گرفته باشد، در كنار شعله با پنس استريل (شرايط آسپتيك) از پاكت آن خارج نماييد و در داخل لوله حاوي محيط كشت تريپتيك سوي براث (TSB) يا سوي بين كازئين دايجست براث تلقيح كنيد. به همراه ساير لوله ها، حداقل به مدت 48 ساعت در دماي 1 ± ˚C36 انكوبه نماييد، لوله محيط كشت را هر روز از نظر ايجاد كدورت كه علامت رشد باكتريايي است، بررسي نماييد. اگر در لوله كنترل مثبت رشد و كدورت ايجاد نشود، نتايج ساير لوله ها قابل اعتماد نمي باشد.

20. كنترل منفي: هميشه از يك لوله كنترل منفي در كنار ساير لوله هاي حاوي نوار كاغذي انديكاتور بيولوژيك استفاده كنيد. اين لوله فقط حاوي محيط كشت است و براي بررسي آلوده نبودن محيط كشت، در كنار ساير لوله هاي حاوي نوار كاغذي انديكاتور بيولوژيك، داخل انكوباتور قرار مي گيرد. اين لوله را به همراه ساير لوله ها حداقل به مدت 48 ساعت در دماي 1 ± ˚C36 انكوبه نماييد، لوله محيط كشت را هر روز از نظر ايجاد كدورت كه علامت رشد باكتريايي است، بررسي نماييد. اگر در لوله كنترل منفي كدورت ايجاد شود، نتايج ساير لوله ها قابل اعتماد نمي باشد.