1. Razmena genetičkog materijala kod prokariota
Horizontalni transfer gena

2. Mehanizmi razmene naslednog materijala kod bakterija
Jednosmeran prenos dela genetičkog materijala iz ćelije donora u ćeliju recipijenta
konjugacijom
transformacijom
transdukcijom
posredstvom GTA (gene transfer agent)
Sudbina primljene DNK:
Degradacija restrikcionim endonukleazama
Opstaje kao autonomni replikon (plazmid ili fagna DNK) - komplementacija nedostajućeg svojstva na hromozomu recipijenta
Rekombinacija sa hromozomom recipijenta – nastaje rekombinant

3. Rekombinacija
Fundamentalan ćelijski proces odgovoran za fizičku razmenu genetičkog materijala između različitih genetičkih elemenata.
homologa rekombinacija
mesto-specifična (“site-specific”) rekombinacija
ilegitimna rekombinacija

4. Homologa rekombinacija
Fundamentalni biološki proces, uključuje RecA zavisnu razmenu homologih sekvenci DNK različitog porekla.
Kod E.coli postoje dva glavna puta (RecBCD, RecF) HR.
RecA protein se polimerizuje na ssDNK (5'3' smer) i formira se nukleo-proteinski filament koji ima afinitet za homologi segment dsDNK (invazija lanca).
Prekid se formira u homologom segmentu na lancu iste polarnosti i lanci se unakrsno povezuju (Holidejeva struktura).
Holidejeva struktura migrira i formiraju se heterodupleksi.

5. Detekcija rekombinanata
Odaberemo donora i recipijenta tako da se razlikuju po svojstvu koje pratimo: Donor:Trp+ (sintetiše triptofan)
Recipijent:Trp- (ne sintetiše trp)
Podloga: MM (minimalni medijum)
ukoliko nakon transfera DNK zasejemo samo recipijente, rastu samo rekombinanti koji su postali Trp+)

6. Konjugacija Zahteva direktan kontakt ćelija
Kodirana konjugativnim plazmidom (KP)
tra region
Donor uvek poseduje KP
Recipijent nikada ne poseduje KP
Dve varijante
Prenos KP
Drugi genetički elementi mogu biti mobilisani (ne-KP ili hromozom)
F plazmid (fertility factor)

7. Transfer konjugativnog plazmida
Gram-negativne bakterije – isključivo preko pilusa
Retrakcija pilusa – formiranje konjugativnog mostića
U donorskoj ćeliji replikacija plazmidne DNK – mehanizam kotrljajućeg obruča
TraI enzim zaseca 1 lanac plazmidne DNK na oriT lokusu (endonukleaza) i raspliće lanac (helikaza)
Replikacija istiskuje 1 lanac u ćeliju recipijenta
U ćeliji recipijenta – sinteza nedostajućeg lanca i cirkularizacija
Rezultat – obe ćelije su F+
Transfer konjugativnog plazmida

8. Transfer hromozoma konjugacijom
F je epizom - integracija F u hromozom
Rekombinacija specifična za mesto u regionu IS
Nekoliko IS sekvenci na plazmidu, ali više kopija IS i na hromozomu - može se desiti na većem broju mesta
Kada se F plazmid integriše u hromozom formira se Hfr soj (High Frequency of Recombination)

9. Transfer hromozoma konjugacijom
Konjugacija Hfr x F-: prelazak hromozoma u ćeliju recipijenta
Najčešće pređe samo deo hromozoma (veza je fragilna – prekid DNK tokom transfera i razdvajanje konjugativnog para)
Primljeni fragment donorske DNK se mora integrisati u hromozom rekombinacijom ili će biti degradovan)
Transfer kompletnog hromozoma domaćina je veoma redak, traje 100 min (brz proces -100 kbp se prebaci za 5min).
Proces se koristio za mapiranje hromozoma kod E. coli (položaj gena u minutima)
Rezultat: Hfr i F- ćelija (transfer celog F faktora veoma redak)

10. Konjugacija F’ x F-
Rekombinacija specifična za mesto između IS sekvenci na hromozomu i plazmidu – dvosmerni proces:
Integracija F faktora u hromozom
Izvlačenje F faktora iz hromozoma
Izvlačenje pogrešno – deo hromozoma se ’ponese’
F’ – oznaka da F faktor nosi neki gen sa hromozoma
Konjugacija – velika frekvenca prenosa gena integrisanog u F
Nalik specijalizovanoj transdukciji

11. Da bi odgovorili na pitanje da li bakterije mogu da razmenjuju genetički materijal i da li poseduju neki proces sličan seksualnoj reprodukciji i rekombinaciji kod vi{ih organizama, J. Lederberg i E. Tatum su godine postavili eksperiment sa sojevima bakterije E. coli.
Izabrali su auksotrofne sojeve koji ne mogu da rastu na minimalnom medijumu (MM): soj A, auksotrof za metionin i biotin (met –bio –thr +leu+ thi +), a soj B auksotrof za treonin, leucin i tiamin (met +bio +thr -leu -thi -).
Da bi ovi sojevi uspešno rasli na MM i formirali kolonije, bilo je potrebno dodati odgovaraju}e faktore rasta u MM.
Međutim, ukoliko se sojevi prvo zajedno inkubiraju u bogatom hranljivom medijumu pa nakon toga zaseju na MM, došlo }e do rasta i pojave pojedinačnih kolonija, 1 kolonija na 106 smeše zasejanih ćelija.
Pošto na MM mogu da rastu samo prototrofi, autori su zaključili da se rekombinacijom auksotrofnih sojeva A i B formirao prototrof, soj sa potpuno novim genotipom (met +bio +thr +leu +thi +), sposoban da sinteti{e sve neophodne faktore rasta i formira kolonije na MM.
Potvrda da novonastali genotip nije rezultat povratne mutacije bilo je odsustvo spontanih mutanata na MM sa pojedinačno zasejanim A i B sojevima.
Lederberg i Tejtum, 1946

12. Eksperimentom B. Davis-a (1950
Eksperimentom B. Davis-a (1950. godine) odbačena je sumnja da izme|u sojeva A i B nije došlo do razmene gene, već da se u toku zajedničkog rasta medijum obogaćuju hranljivim materijama, ili da se mali fragmenti DNK iz liziranih }elija unosi procesom transformacije.
Krajevi posude u obliku slova U razdvojeni su filterom sa porama koje ne dozvoljavaju prolaz bakterija ali omogu}avaju nesmetani protok tečnog medijuma i supstanci rastvornih u njemu.
Sojevi A i B su zasejani u različite krake ovog suda, a nakon određenog perioda, proveravan je rast na MM podlozi.
Odsustvo rasta odvojeno gajenih sojeva na MM bilo je potvrda da je za nastanak soja sa novim genotipom neophodan direktni kontakt ćelija.
Dejvis, 1950

13. Kako selektovati transkonjugante (rekombinante nastale procesom konjugacije)?
Hfr donor: prototrof (thr+, leu+), koristi laktozu (lac+), osetljiv na antibiotik (npr. streptomicin - strS)
Recipijent: auksotrof (thr-, leu-), ne koristi laktozu (lac-), otporan na antibiotik streptomicin strR)
Selekcija rekombinanata:
1. [ MM +str+glukoza ] → rastu rekombinanti koji su postali Thr+ i Leu+
2. [ MM+str+laktoza (nema glukoze)+ thr+leu ] → rastu rekombinanti koji su postali Lac+
3. [ MM+str+laktoza (nema glukoze) ] → rastu rekombinanti koji su postali Thr+ i Leu+ i Lac+

14. Transdukcija Transfer gena iz donora u recipijenta pomoću virusa
Generalizovana transdukcija – prenos bilo kojeg fragmenta DNK donora u recipijenta. Efikasnost niska.
Specijalizovana transdukcija – prenos određenog dela DNK donora u recipijenta. Efikasnost može biti veoma visoka.

15. Generalizovana transdukcija (model P1 fag) Umesto virusne DNK u virusnu česticu se upakuje bilo koji fragment domaćinove DNK odgovarajuće veličine (virus postaje ’defektan’, transdukujući fag) Sledeća infekcija – fag ne može kompletirati svoj ciklus (nedostaju mu sopstveni geni) ali može doći do rekombinacije sa hromozomskom DNK

16. Specijalizovana transdukcija (model λ fag)
DNK umerenog virusa (profag) se pogrešno iseca iz hromozoma domaćina noseći deo svoje DNK i susedne gene domaćina
Pakovanje takve DNK u kapsid – transdukujući fagi

17. λ fag se integriše između gena gal i bio → izvlačenje profaga može da ponese ili gal ili bio. Specijalizovana transdukcija – transfer ili gal ili bio. Homologa rekombinacija sa hromozomom recipijenta.

18. Otkriće transformacije, Grifit 1928
Streptococcus pneumoniae
S ćelije sa kapsulom (kapsula je faktor patogenosti)
R ćelije mutanti bez kapsule (nepatogene)
Hemijska priroda “transformišućeg principa” – molekul DNK
(Averi, 1944)

19. Kompetencija (sposobnost transformacije)
Sposobnost prihvatanja gole DNK
Prirodna: Azotobacter, Bacillus, Haemophilus, Streptococcus, Neisseria, Thermus
Veštačka: E. coli
Indukovana elektroporacijom
Indukovana termalnim šokom i Ca2+ jonima
Lakši ulaz cirkularne DNK (plazmida)
Odakle slobodni fragmenti DNK u prirodi?
Liziranje mrtvih ćelija
Velika dužina genoma – velika tendencija fragmentacije
B. subtilis (1,7mm – 4.2 megabp) → nastaju fragmenti dužine 10kbp ~ 10tak gena

20. Transformacija
Indukcija prirodne kompetencije - quorum sensing fenomen kod B. Subtilis.
Za kompetenciju odgovorni DNK vezujući proteini asocirani sa membranom, autolizini ćelijskog zida i nukleaze – Com proteini.
Com proteini (regulišu quorum sensing odgovor, učestvuju u vezivanju DNK i formiranju pore za njen prolazak).
Uzimanje slobodne DNK često uz degradaciju jednog lanca.
Integracija u hromozom recipijenta homologom rekombinacijom
Kod Haemophylus influenzae neophodna specifična 11bp sekvenca da bi recipijent mogao da veže i primi stranu DNK (sekvenca ponovljena u mnogo kopija duž celog genoma).

21. Horizontalni transfer gena posredstvom GTA (GTAs - gene transfer agents)
Mehanizama horizontalnog transfera genetičkog materijala među prokariotima koji je poslednji otkriven.
Ostvaruje posredstvom tzv. GTA čestica, struktura nalik fagnim česticama, koje imaju kompleksnu građu (struktura: glava – repić).
GTA čestice su prisutne u oba prokariotska domena (neke sulfat-redukujuće bakterije i metanogene arhee), a dominantno se javljaju u marinskim ekosistemima.
GTA nisu rezultat virusne infekcije već se formiraju zahvaljujući ekspresiji gta gena koji se nalaze na hromozomu.
Ekspresija ovih gena dovodi do fragmentacije bakterijskog genoma i sinteze proteina koji formiraju ’kapsid’, nalik onom koji se javlja kod bakteriofaga.
Pošto dođe do pakovanja celokupnog genoma u veliki broj ovako nastalih čestica, dolazi do lize ćelije i oslobađanja GTA u okolni prostor.
Na ovaj način donorska ćelija je žrtvovana, a upakovani fragmenti mogu biti ubačeni u recipijentne ćelije u populaciji.
Ukoliko dođe do homologe rekombinacije, nova svojstva će biti stabilno integrisana u DNK recipijenata, što će povećati genetičku varijabilnost date populacije.

22. Horizontalni transfer gena posredstvom GTA
Na hromozomu se nalaze gta geni odgovorni za sintezu GTA čestica koje nalikuju fagima (struktura – glava repić), ali nisu rezultat virusne infekcije.
U GTA partikulu se nasumice pakuju mali fragmenti hromozomske DNK.
Comparison of gene transfer agent and transducing phage production

24. Rasprostranjenost razmene gena kod Bacteria
Smatra se da ima veliki značaj za evoluciju bakterija
Konjugacija: E. coli, enterične bakterije, Streptococcus, Staphylococcus
Transdukcija: čest proces kod Bacteria
Transformacija: Bacillus, Streptococcus, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria, Thermus (prirodno kompetentne)
Horizontalni transfer gena posredstvom GTA (gene transfer agents) - dokazano je postojanje u oba domena prokariota (neke sulfat-redukujuće bakterije i methanogene arhee)

25. Rasprostranjenost razmene gena kod Archaea
Prisustvo horizontalnog transfera gena - manje proučavano (teža kultivacija, gajenja na čvrstim podlogama i dobijanja pojedinačnih kolonija, itd.).
Konjugacija: Sulfolobus solfataricus – postoji konjugativni plazmid, proces sličan onome kod bakterija, jednosmerni transfer DNK, nema pila, ali se formira citoplazmatični mostić.
Specifična konjugacija kod nekih halofila - ćelije nemaju konjugativni plazmid, ali dolazi do dvosmernog transfera DNK preko citoplazmatičnog mostića.
Transformacija - problem sticanja kompetencije: uklanjanje dvovalentnih jona metala destabiliše glikoproteinske zidove Archaea i omogućava prodor strane DNK u ćeliju
Transdukcija - retka, dokazana kod Methanothermobacter thermautotrophicus
Horizontalni transfer gena posredstvom GTA (gene transfer agents) - dokazano je postojanje u oba domena prokariota (neke sulfat-redukujuće bakterije i methanogene arhee)

26. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - CRISPR
CRISPR i asocirani proteini (Cas) čine CRISPR-Cas sistem - omogućava adaptivni imunitet bakterija i arhea prema dejstvu egzogenih elemenata (uloga kao i imunitet kod sisara).
Cas proteini imaju: RNK prepoznavajući motiv (RNA recognition motif RRM), domene koji interaguju i vezuju se za DNK i RNK, uloge nukleaze ili helikaze.
CRISPR- dirigovana imunizacija:
- DNK invazivnog genetičkog elementa (plazmid, virus) integriše se u CRISPR lokuse koji sadrže kratke palindromske ponovke DNK u regularnim intervalima,
- tako se formiraju lokusi sa alternativnim ponovljenjim elementima (CRISPR repeats) i varijabilnim sekvencama (CRISPR spacers).
Ovi lokusi se kasnije transkribuju u male interferirajuće RNK koje navode nukleaze da specifično razgrađuju komplementarne sekvence (DNK ili RNK).

27. Overview of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR associated (Cas) adaptive immunity.
(a) Adaptation. The CRISPR arrays are composed of short repeats and intervening sequences derived from foreign invaders. Upon infection with a foreign element (e.g., phages or plasmids), part of the genome is typically incorporated into the leader end of the CRISPR array and the repeat is duplicated. The CRISPR arrays are located adjacent to a cluster of cas genes;
(b) crRNA generation. The CRISPRs are transcribed into pre-crRNAs that are then processed into mature crRNAs;
(c) Interference. The crRNA, in a complex with Cas proteins, binds and degrades the target nucleic acid of the invading element.
Viruses 2012, 4, ; doi: /v

28. CRISPR sistem – zaštita ćelijskog genoma od strane DNK
Prokariotsko ’imunološko pamćenje’ – sistem koji memoriše sekvence strane DNK koje su prodirale u ćeliju
Prisustvo CRISPR sistema dokazano u genomima 90% arhea i 70% bakterija

30. Tehnologija rekombinantne DNK - genetičko inženjerstvo
Skup in vitro tehnika kojima je omogućeno stvaranje himernih molekula DNK, korišćenje in vitro tehnika za izmene genetičkog materijala u laboratoriji.
Kloniranje gena:
Izolovanje gena iz organizma
Prebacivanje u manje genome - vektore za kloniranje
Ubacivanje u ćeliju domaćina
Selekcija transformisanih ćelija i identifikacija klona koji sadrži željeni gen
Amplifikacija gena u domaćinu ili ekspresija stranog proteina u domaćinu
Primena u istraživanju ili komercijalnoj proizvodnji korisnih produkata

31. Restrikcione endonukleaze
Prisutne u oba domena prokariota.
Dimeri, seku dvolančanu DNK na palindromskim sekvencama koje nisu modifikovane (najčešće asimetrično) ostavljajući kratke jednolančane komplementarne krajeve (lepljivi krajevi, ‘sticky ends’).
Dobijaju ime prema bakteriji iz koje su izolovane (EcoRI, HindIII, BsuRI, BamHI itd).

32. Dobijanje himernih DNK molekula
Tretiranje izolovane DNK restrikcionom endonukleazom.
Tretiranje DNK vektora istim enzimom.
Razdvajanje fragmenata pomoću gel elektroforeze.
Povezivanje molekula pomoću DNK ligaze.
Ubacivanje u ćeliju domaćina transformacijom.

33. Vektori za kloniranje i njihove osobine
Plazmidi, derivati prirodnih plazmida
Virusi, uglavnom bakteriofagi
Kozmidi
Veštački hromozomi
Ekpresioni vektori
Šatl vektori
Dobro okarakterisani, mali DNK molekuli (po pravilu do 10 kbp) koji se autonomno se repliciraju i prenose u ćerke ćelije (autonomni replikoni).
Imaju selektabilne genetičke markere.
Imaju jedno restrikciono mesto za pojedinu restrikcionu endonukleazu.

34. Plazmidni vektori: Plazmid pBR322
Prvi konstruisani plazmidni vektor, (poreklo ColE1).
Poseduje ori plazmida ColE1, pa je broj kopija po ćeliji je
Nalaze geni za rezistenciju za dva antibiotika:
- bla gen, poreklom od transpozona Tn3, koji kodira -laktamazu, rezistencija na ampicilin (razgradnja antibiotika enzimom -laktamazom) i
- tet gen, rezistenciju na tetraciklin (protein koji obezbeđuje rezistenciju na tetraciklin nalazi se u membrani i izbacuje antibiotik u spoljašnju sredinu). U okviru gena tet restrikciono mesto BamH1.
Domaćin je osetljiv na oba antibiotika; uspešno kloniranje: ćelije nosioci kloniranog gena su ampRtetS

35. Plazmidni vektori: pUC plazmidi
pUC vektori sadrže deo lacZ gena koji kodira enzim -galaktozidazu.
-galaktozidaza se može fizički podeliti na dva fragmenta:  (oko 60 aminokiselina) i  (oko 960 aminokiselina) čijom se asocijacijom dobija funkcionalni enzim.
Na pUC vektoru se nalazi sekvenca za sintezu -fragmenta koja sadrži restrikciona mesta za inserciju kloniranog gena.
Ukoliko vektor nema inserciju, a ćelija sintetiše  fragment, -galaktozidaza će biti funkcionalna, pa će se na podlozi sa analogom laktoze Xgal (5-bromo-4-hloro-3-indolil--D-galaktozid) formirati plave kolonije.
Ukoliko je u sekvencu -fragmenta inseriran deo strane DNK nema sinteze funkcionalnog enzima, pa će se na Xgal podlozi formirati bele kolonije
Da bi se povećao broj restrikcionih enzima koji se mogu koristiti za kloniranje, pUC plazmidi sadrže polilinker sekvencu u sekvenci za sintezu -

36. Identifikacija klona
Izborom odgovarajućeg vektora, koji nosi pogodne ’reporter gene’ (selektabilne markere) pr. pBR322 - nosi gene za rezistenciju na amp i tet; pUC plazmidi – nose lacZ gen.
Hibridizacijom DNK sa obeleženim probama) nakon lize ćelija).
Upotrebom obeleženih antitela za željeni proteinski produkt (u slučaju ekspresionih vektora).

37. Plazmidni vektori: Ekspresioni vektori
Vektori za studiranje ekspresije gena (sadrže “reporter” gene, npr. lacZ)
Da bi se omogućila kontrolisana transkripcija i translacija kloniranog gena, odnosno sinteza rekombinantnog proteina, koriste se tzv. ekspresioni vektori (npr. promotori lac ili ara operona).
Dodavanjem u medijum laktoze ili njenog analoga, izopropil--D-tiogalaktozida (IPTG), indukuje se lac promotor.
Ukoliko se klonirani gen eksprimira u eukariotskoj ćeliji onda se u ekspresioni vektor ubacuje promotor koji je aktivan u toj vrsti ćelija. Korišćenjem ekspresionih vektora moguća je produkcija velike količine proteina.
Ekspresioni vektor

38. Fagni vektori za kloniranje- Modifikacijom fagnih genoma dobijaju se vektori sa selektivnim markerima i pogodnim restrikcionim mestima.
 vektori
Kod  litičkog vektora genetička informacija neophodna za ulazak u lizogeni ciklus se može ukloniti i zameniti kloniranim genom, tako da nastali fag može ući samo u litički ciklus. Veličina DNK koja se može klonirati u ovaj vektor je i do 10 kb.
Fagna DNK se može ubaciti u ćeliju E. coli transfekcijom ili se može in vitro upakovati u kapsid i zatim adsorbovati na bakteriju domaćina, gde će se umnožiti. Uz pomoć litičkih vektora može se dobiti velika količina čiste DNK.
lizogeni vektori - ubacivanje klonirane DNK u hromozom E. coli, mesto specifičnom rekombinacijom između attP i attB regiona. Pogodni su za studiranje samo jedne kopije gena i njegovog produkta.

39. Fagni vektori M13 vektori ssDNK virus → lako sekvenciranje.
Ima dsDNK oblik (replikativna forma) neophodan za kloniranje.
Inficirane ćelije se održavaju u životu, virus ih ne lizira, tako da mogu biti kontinuirani izvor klonirane DNK.
Intergenski prostor koji ne kodira proteine i koji se može zameniti stranom DNK je dovoljno veliki.
DNK se pakuje prolaskom kroz membranu, veličina fagne partikule nije fiksna, zavisi od veličine upakovanog fragmenta.

40. Kozmidi (kombinacija plazmidnog vektora i cos mesta λ faga) – pakovanje plazmidne DNK u glavu faga, klonirani fragmenti do kb

41. Shuttle vektori (plazmidi koji sadrže ori i selektabilne markere karakteristične za dva domaćina, npr. E. coli i B. subtilis ili eukariotska ćelija)
“Artificial chromosome” (veštački hromozomi, klonirani fragment do 1000 kb)
Kozmidi (na bazi λ faga)
PACs (na bazi P1 faga)
BACs (na bazi bakterijskog hromozoma)
YACs (na bazi hromozoma kvasca)
HACs (na bazi humanog hromozoma)

42. Ćelije domaćini za kloniranje

43. Genske biblioteke
Kolekcije rekombinantnih klonova koji sadrže sve gene nekog organizma
Genska biblioteka – kompletan genom
cDNK biblioteka – kodirajuće sekvence genoma
Izolacija ukupne iRNK iz ćelije (hibridizacijom polyA repa sa polyT fragmentima na koloni)
korišćenje reverzne transkriptaze – sinteza cDNK
Isecanje restrikcionim endonukleazama i kloniranje u vektor

44. Konstrukcija probe na osnovu iRNK - cDNK

45. Određivanje primarne strukture gena – sekvenciranje DNK
Za određivanje primarne strukture kloniranog gena postoji više metoda.
Metoda po Maksamu i Gilbertu se zasniva na fragmentaciji DNK molekula.
Prvo se 5’ krajevi fragmenta koji se sekvencira obeleže radioaktivnim fosforom, zatim se dvolančana DNK denaturiše i lanci se razdvoje.
U četiri reakcione smeše jednolančani fragmenti se podvrgnu hemijskom tretmanu kojim se specifično raskidaju lanci na mestima gde se nalazi određena baza (A, G, C ili T).
Pošto su eksperimentalni uslovi takvi da se raskidanje lanca odvija samo na po jednom mestu u okviru jednolančanog fragmenta, dobijaju se produkti različitih dužina, a svaki se u istoj reakcionoj smeši završava istom bazom.
Reakcione smeše se analiziraju pomoću elektroforeze, kojom se mogu razdvojiti lanci koji se razlikuju samo za po jedan nukleotid.
Pozicije fragmenata lociraju se autoradiografijom i na osnovu podatka kojoj bazi odgovara koja elektroforetska linija može se pročitati sekvenca.
Ovom metodom se može odrediti sekvenca DNK fragmenta dužine do 250 nukleotida.

46. Određivanje primarne strukture gena – sekvenciranje DNK
Metoda po Maksamu i Gilbertu (primena nukleaza)
Sangerov metod - dideoksi metod (primena dideoksi analoga nukleotida i DNK polimeraze); Nobelova nagrada

47. Metoda Sangera
U Sangerovoj metodi sekvenca se određuje kopiranjem jednolačane DNK uz pomoć DNK polimeraze.
Ova metoda se naziva i dideoksi metoda, jer se u 4 inkubacione smeše, pored normalnih dezoksiribonukleozid trifosfata, dodaje i mala količina njihovih dideoksiribonukleozid trifosfatnih analoga, po jedan za svaku reakcionu smešu.
Pošto dideoksi šećer nema 3’- hidroksilnu grupu, na mestu gde se on ugradio prestaje sinteza DNK.
U zavisnosti od mesta gde se dideoksinukleotid ugradio dobijaju se novosintetisani fragmenti različitih dužina.
Fragmenti su radioaktivno obeleženi pomoću radioaktivnog prajmera ili zbog prisustva radioaktivnih dezoksiribonukleozid trifosfata u reakciji.
Nakon urađene elektroforeze, pozicije traka određuju se autoradiografijom sa koje se direktno može pročitati sekvenca.
Metoda Sangera se može koristiti i za dobijanje sekvence RNK uz pomoć enzima reverzne transkriptaze, koji koristi RNK molekul kao templet za sintezu komplementarne jednolančane DNK.
U reakciji sekvenciranja odvija se sinteza DNK na RNK matrici u prisustvu dideoksinukleozid trifosfata.
Na osnovu dobijene sekvence DNK može se zaključiti o sekvenci RNK. Sanger metod se veoma često koristi za sekvenciranje ribozomalne RNK u studijama filogenetske srodnosti mikroorganizama.
Ovim metodom se može odrediti sekvenca DNK fragmenta dužine do 500 nukleotida.

48. Metoda Sangera
Našla primenu i u sekvenciranju RNK molekula (isti princip, samo se koristi reverzna transkriptaza)
Automatski sistemi za sekvenciranje (dideoksi metod, ali obeležavanje nije radioaktivitetom, već je svaki nukleotid obeležen različitom fluorescentnom bojom
Sekvenciranje većih molekula i čitavih genoma – strategija shotgun sequencing (sekvenciranje nasumično isečenih fragmenata i rekonstrukcija celokupne sekvence na osnovu preklapanja sekvenci)

49. Konstrukcija probe na osnovu poznate sekvence aminokiselina

50. Sinteza DNK fragmenta (oligonukleotida)
Sinteza probe ili prajmera za PCR reakciju
Sinteza in vitro korišćenjem solid phase procedure (prvi nukleotid je vezan za čvrst nosač – silika gel)
U zavisnosti od željene sekvence, u reakcionu smešu se dodaje samo jedan odgovarajući nukleotid (hemizam reakcije komplikovan)
Između svakog dodavanja vrši se ispiranje nevezanih nukleotida

51. Umnožavanje DNK (PCR reakcija)
Lančana reakcija polimeraze (polymerase chain reaction)
Malis (Mullis), 1993, Nobelova nagrada
dsDNK templet, 2 in vitro sintetisana prajmera, Taq (Thermus aquaticus) ili Pfu (Pyrococcus furiosus) polimeraza
Ciklus:
90-95°C razdvajanje lanaca - denaturacija
55°C vezivanje prajmera za jednolančane templete
70°C ekstenzija prajmera (sinteza DNK)
Ponavljanje ciklusa puta

52. PRIMENA KLONIRANJA U GENETICI BAKTERIJA
Tehnikama rekombinantne DNK omogućeno je uvođenje mutacije u tačno određeni gen, tzv. dirigovana (site-directed) mutageneza.
Gen se klonira u plazmidni vektor koji se denaturiše da bi se dobila jednolančna DNK.
Sintetisani oligonukleotid sa određenom mutacijom (G naspram A) se komplementarno vezuje za target sekvencu i služi kao prajmer za kompletiranje drugog lanca.
Propagacijom heterodupleksa u transformisanim ćelijama E. coli dobija se oko 50% plazmida sa mutacijom.
Dirigovana (site directed) mutageneza

53. Primena kloniranja u genetici bakterija
Gen se klonira na plazmid i u njega se ugrađuje DNK fragment (kaseta) koji nosi rezistenciju na antibiotik (kanamicin).
Plazmid se zatim linearizuje i njime se transformiše domaćin.
Rekombinacijom između gena na plazmidu i hromozomu, kaseta se uvodi u hromozomski gen.
Ćelije koje imaju inaktivirani gen selektiraju se na odgovarajućem antibiotiku.
Inaktivacija specifičnog gena tehnika (cassette mutagenesis)

54. Molekularna biotehnologija - Transgeni organizmi u poljoprivrednoj proizvodnji
Ti plazmid (iz Agrobacterium tumefaciens) kao vektor za transformaciju biljnih kultura (T-DNK se integriše u hromozom biljne ćelije).
Ti-vektorski sistem obuhvata i binarni vektor (binary vector) sastavljen iz klonirajućeg vektora i helper plazmida – može se replicirati u E. coli i A. tumefaciens (u grupi shutlle vektora).
Transgene biljke su otporne prema herbicidima, insektima (ukloniran gen za proizvodnju insekticidnog proteina Bacillus thuringiensis - Bt toksin), ekstremnim uslovima spoljašnje ...
Transgene ribe – brzorastuća pastrmka (fast-growing salmon) – omogućena je proizvodnja hormona rasta tokom cele godine (kod nemodifikovanih riba samo tokom letnjih meseci).

55. Molekularna biotehnologija - Primena transgenih organizama u medicini
Genetski modifikovani mikroorganizmi u proizvodnji
Proteina krvi (urokinaze, eritropoetin, tkivni plazminogeni aktivatori...)
Hormona (insulin, hormon rasta, relaksin...)
Imunomodulatora (interferona, interleukina...)
Rekombinantne vakcine
Novi terapeutici
antikancerski agens – genetski modifikovana, slabo virulentna Listeria monocytogenes koja nosi radionuklide – selektivno eliminišu tumorske, ali ne i zdrave ćelije, terapija kancera pankreasa)

56. Molekularna biotehnologija