1. Antibiogram By:Dr. S. S. Khoramrooz In the name of God
Department Of
Microbiology
Yasouj University of Medical Sciences
Antibiogram
By:Dr. S. S. Khoramrooz
Department of Microbiology, Faculty of Medicine,
Yasuj University of Medical Sciences, Yasuj, Iran

2. آنتی بیوگرام
بررسی تعیین حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک های مورد استفاده و شناسایی مقاومت در باکتریها
عدم نیاز به بررسی حساسیت در بعضی باکتریها
استرپتوکوکوس پایوژنز
انجام تست در باکتریهایی که ژنهای مقاومت را کسب میکنند
انتروباکتریاسه
سودوموناس
استافیلوکوکوس
انتروکوکوس
استرپتوکوکوس پنومونیه
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

3. آنتی بیوگرام آنتی بیوگرام:
تعیین حساسیت یا مقاومت میکروبها نسبت به مواد ضد میکروبی در آزمایشگاه
روشهای مختلف:
Broth-Macrodilution (tube-Dilution) Tests
Broth-Microdilution Tests
Agar-Dilution Tests
E-test
Disk Agar Diffusion
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

4. Broth-Microdilution Tests
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

5. Broth-Microdilution Tests
A broth microdilution susceptibility panel containing 98 reagent wells and a disposable tray inoculator.
A broth microdilution susceptibility panel containing 98 reagent wells and a disposable tray inoculator
Reller L B et al. Clin Infect Dis. 2009;49:
© 2009 by the Infectious Diseases Society of America

6. Antimicrobial susceptibility testing using micro-broth dilutions
ug/ml •
96 well microtiter plate

7. Minimal Bactericide Concentration
MIC
The lowest concentration of antibiotic that prevented growth represented the Minimal Inhibitory Concentration.
MBC
Minimal Bactericide Concentration
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

8. E- test
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

9. E- test
A Staphylococcus aureus isolate tested by the Etest gradient diffusion method with vancomycin (VA), daptomycin (DM), and linezolid (LZ) on Mueller-Hinton agar.
A Staphylococcus aureus isolate tested by the Etest gradient diffusion method with vancomycin (VA), daptomycin (DM), and linezolid (LZ) on Mueller-Hinton agar. The minimum inhibitory concentration of each agent is determined by the intersection of the organism growth with the strip as measured using the scale inscribed on the strip.
Reller L B et al. Clin Infect Dis. 2009;49:
© 2009 by the Infectious Diseases Society of America

10. روش دیسک آگار دیفیوژن Disk Agar Diffusion
تهیه سوسپانسیون میکروبی خالص برابر با کدورت استاندارد
مک فارلند
استفاده از سواب جهت انتقال سوسپانسیون به محیط کشت
مولر هینتون و پخش آن در سطح محیط کشت
قرار دادن دیسک های حاوی آنتی بیوتیک در سطح محیط کشت
انکوباسیون در دمای مناسب
بررسی نتایج و تفسیر
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

11. تهيه كدورت استاندارد نيم مك فارلند
1- هدف:
جهت استاندارد کردن غلظت تلقيح براي آزمايش تعيين حساسيت ميكروبي، استفاده از استاندارد سولفات باريم (BaSo4)، برابر با استاندارد نيم مک فارلند
2- مواد و ابزار لازم:
کلرور باريم دهيدراته، اسيدسولفوريک، مزور، بالن ژوژه، لوله آزمايش در پيچ دار استريل

12. 3- روش انجام کار:
استاندارد نيم مک فارلند سولفات باريم به روش زير تهيه مي شود :
0/5 میلی لیتر از کلرور باريم ((BaCl2) mol/l 0/048 )
(2H2O . W/VBaCl21/175%
5/ 99 میلی لیتر اسيد سولفوريکmol/l 0/18 (V/V 1%) اضافه کنيد و با هم زدن مداوم سوسپانسيون بدست آوريد.
2) چگالي صحيح کدورت استاندارد با استفاده از اندازه گيري جذب در اسپکترو فتومتر با طول مسیر نوري cm1، مشخص شود. جذب در nm625 بايد بين 0/08 تا 0/13 باشد.

13. 3) سوسپانسيون سولفات باريم بايد به مقدار ml6-4 در لوله هاي در پيچ دار هم اندازه با لوله هاي سوسپانسيون باکتريايي ريخته شود.
4) درب اين لوله ها بايد محکم بسته شوند و نگهداری در دماي اتاق و در تاريکي .
5) همزدن استاندارد سولفات باريم قبل از هر بار استفاده به شدت (ترجيحا با ورتکس مکانيکی)، جهت ايجاد کدورت يکنواخت. در صورت مشاهده ذرات بزرگ، بايد استاندارد تازه اي تهيه گردد.
6) استاندارد سولفات باريم بايد به صورت ماهانه جايگزين شود يا جذب آن اندازه گيري گردد.

14. Dr. S. S. Khoramrooz

15. Antimicrobial discs
Stocks of antimicrobial discs should preferably be kept at -20 ∞C
A small working supply of discs can be kept in the refrigerator for up to 1 month
Turbidity standard
0.6 ml of a 1% (10 g/l) solution of barium chloride dihydrate into a 100-ml graduated cylinder,
filling to 100ml with 1% (10 ml/l) sulfuric acid.
The turbidity standard solution should be placed in a tube identical to the one used for the broth sample.
It can be stored in the dark at room temperature for 6 months.
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

16. روش دیسک آگار دیفیوژن Susceptibility Testing Methods
Incubate plate
18-24 hr, 35 C
Measure and record zone of inhibition around each disk
Innoculate
MH plate
Place disks
on agar plate

17. Disk Diffusion Susceptibility Testing
Mueller Hinton agar &
good disk placement
Improper agar & disk placement
Use Mueller Hinton agar

18. اندازه گیری قطر منطقه تعیین حساسیت
اندازه گیری قطر منطقه تعیین حساسیت
اندازه گیری قطر هاله عدم رشد
حساس (Sensitive; S)
نیمه حساس (Intermediate; I)
مقاوم (Resistant; R)
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

19. 12/2/2018
S. S. Khoramrooz

20. 12/2/2018
S. S. Khoramrooz

21. 12/2/2018
S. S. Khoramrooz

22. Antimicrobial discs
Stocks of antimicrobial discs should preferably be kept at -20 ∞C
A small working supply of discs can be kept in the refrigerator for up to 1 month
Turbidity standard
0.6 ml of a 1% (10 g/l) solution of barium chloride dihydrate into a 100-ml graduated cylinder,
filling to 100ml with 1% (10 ml/l) sulfuric acid.
The turbidity standard solution should be placed in a tube identical to the one used for the broth sample.
It can be stored in the dark at room temperature for 6 months.
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

23. 12/2/2018
S. S. Khoramrooz

24. Quality control These tests should preferably
Standard procedure for quality control
Standard strains for quality control
These tests should preferably
be run every week, or with every fifth batch of tests, and, in addition, every time a new batch of Mueller–Hinton agar or a new batch of discs is used.
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

25. Preparing the inoculum
The cultures may be inoculated into any type of broth, and incubated until the broth is turbid.
Each broth should be streaked onto an agar plate and incubated overnight.
Single colonies should then be picked off and submitted to susceptibility tests.
Placing antimicrobial discs
After the inoculum has been streaked on to the plates, the appropriate discs should be applied. The discs to be selected for each control strain .
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

26. Reading the plates
After 16–18 hours incubation, the diameters of the inhibition zones should be measured with a ruler and recorded, together with the date of the test, on a special quality control chart.
When the results consistently fall outside the acceptable limits,
action
Grossly aberrant results, which cannot be explained by technical errors in the procedure,
may indicate contamination or sudden changes in the susceptibility or growth characteristics of the control strain.
If this occurs, a fresh stock strain should be obtained from a reliable source.hould be taken to improve the quality of the test.
12/2/2018
S. S. Khoramrooz

27. کنترل کيفيت ديسک هاي آنتي بيوتيک جهت انجام آزمايش تعيين حساسيت ميکروبي به روش disk diffusion agar
Dr. S. S. Khoramrooz

28. هدف از برنامه کنترل کيفي پايش و ارزيابي موارد زير مي باشد:
هدف از برنامه کنترل کيفي پايش و ارزيابي موارد زير مي باشد:
صحت و دقت روش انجام آزمايش تعيين حساسيت
مواد و وسايل به کار برده شده در اين آزمايش
عملکرد افرادي که آزمايش را انجام داده و نتايج بدست آمده را قرائت مي نمايند.
به منظور دست يابي بهينه به اين اهداف در دسترس داشتن سويه هاي کنترل کيفي تهيه شده از مراکز معتبر ضروري است.
Dr. S. S. Khoramrooz

29. سويه هاي کنترل کيفي پيشنهادي توسطCLSI عبارتند از:
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli ATCC 35218
Haemophilus influenzae ATCC 49247
Haemophilus influenzae ATCC 49766
Klebsiella pneumoniae ATCC
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
Dr. S. S. Khoramrooz

30. E.coli ATCC فقط به عنوان يک ميکروارگانيسم کنترلي براي ترکيبات ممانعت کننده بتالاکتاماز، مثل ترکيبات حاوي کلاولانيک اسيد، سولباکتام يا تازوباکتام پيشنهاد مي شود.
Enterococcus faecalis ATCC (يا E.faecalis ATCC 33186) براي ارزيابي محيط مولر هينتون آگار با ديسک تري متوپريم/ سولفامتوکسازول استفاده مي شود.
درمحيط کشت قابل قبول، هاله عدم رشد واضحي به قطر mm 20 يا بزرگتر ايجاد مي شود در حاليكه در محيطهاي کشت غير قابل قبول، هاله عدم رشد ايجاد نمي شود يا در داخل هاله، رشد کم مشاهده مي شود و يا هاله اي با قطر کمتر از mm 20 ايجاد ميگردد.
اين کار به منظور بررسي مقادير غيرقابل قبول تيميدين در محيط کشت مزبور است.
Dr. S. S. Khoramrooz

31. Enterococcus faecalis ATCC 29212 همچنين براي کنترل ديسکهاي آمينو گليکوزيد با دوز بالا به کار مي رود.
Klebsiella pneumoniae ATCC به عنوان يک سويه کنترلی براي آزمايشات ESBL به کار برده مي شود.
Dr. S. S. Khoramrooz

32. کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي
سويه هاي کنترل کيفي را بايد به روش استاندارد آزمايش disk diffusionو با استفاده از همان مواد و روشي که براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي کلينيکي استفاده مي شود آزمايش و نتايج را با جداول 3 و A3 CLSI ( ضميمه 3) مقايسه و بررسي نمود.
محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول براي هر سويه کنترلي نسبت به يک ديسک آنتي بيوتيکي در جداول فوق فهرست شده است.
Dr. S. S. Khoramrooz

33. در اين صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهيه شود.
چنانچه تغيير در ميانگين قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا در روش انجام آزمايش نباشد، احتمالا" ناشي از تغيير در حساسيت ذاتي باکتري نسبت به آن آنتي بيوتيک مي باشد.
در اين صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهيه شود.
Dr. S. S. Khoramrooz

34. آزمايش کنترل کيفيت را بايد درچه فواصل زماني انجام داد؟
آزمايش کنترل کيفيت را بايد درچه فواصل زماني انجام داد؟
الف _ انجام آزمايش روزانه
براي هر سويه کنترلي با يک ديسک آنتي بيوتيکي بايد 20 روز متوالي آزمايش تعيين حساسيت انجام و نتايج با مقادير قابل قبول اشاره شده در جداول فوق مقايسه گردد.
بر اساس ضريب اطمينان 95% تنها يک مورد از 20 نتيجه قرائت شده مي تواند خارج از محدوده كنترل باشد (به ضميمه 2مراجعه کنيد).
چنانچه بيشتر از يک مورد خارج از محدوده کنترل باشد نياز به اقدامات اصلاحي خواهد بود، که در ادامه توضيح داده مي شود.
Dr. S. S. Khoramrooz

35. ب _ انجام آزمايش هفتگي
- در صورتيكه تنها يک مورد از 20 نتيجه قطر هاله عدم رشد براي هر سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي خارج از محدوده قابل قبول مندرج در جداول 3 وA 3 ( ضميمه 3) قرار گيرد ، کنترل کيفي روزانه را به هفتگي تغيير دهيد (به ضميمه 2 مراجعه کنيد).
- آزمايش کنترل کيفي هفتگي را يکبار در هفته و هم چنين زمانيکه يکي از عوامل آزمايش (مانند سري ساخت آگار يا ديسکهای تهيه شده از يک سازنده) تغيير کند، انجام دهيد.
اگر هر يک از نتايج کنترل کيفي هفتگي خارج از محدوده قابل قبول باشد، انجام اقدامات اصلاحي مورد نياز است .
Dr. S. S. Khoramrooz

36. اقدامات اصلاحي (Corrective actions)
الف نتايج خارج از محدوده قابل قبول به دليل خطاهاي مشهود و واضح شامل:
استفاده از ديسک اشتباه
استفاده از سويه کنترلی اشتباه
آلودگي واضح سويه
استفاده غيرعمدی از دما و شرايط اشتباه انکوباسيون بوجود آمده است .
دراين حال بايد دليل ايجاد خطا مکتوب و پس از اصلاح آزمايش دوباره تکرار شود .
اگر نتايج گزارش شده در محدوده مورد نظر قرار گرفت ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد .
Dr. S. S. Khoramrooz

37. ب _ عامل ايجاد نتايج خارج از محدوده کنترل نامشخص است
ب _ عامل ايجاد نتايج خارج از محدوده کنترل نامشخص است. در اين حال بايد اقدامات اصلاحي فوري بشرح زير انجام شود.
آزمايش را جهت يک سويه کنترلي / ديسک آنتي بيوتيکي براي 5 روز متوالي تکرار و همه نتايج را ثبت کنيد.
اگر اندازه هر 5 قطرهاله مطابق جداول 3 و A3 ( ضميمه 3) و در محدوده قابل قبول باشد ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد.
اگر اندازه هر يک از 5 قطر هاله عدم رشد خارج از محدوده قابل قبول باشد ، به عمليات اصلاحي اضافي نياز است.
آزمايشهاي کنترلي روزانه بايد ادامه داده شود تا به دليل نهايي مشکل پي برده شود.
Dr. S. S. Khoramrooz

38. اندازه گيري و ثبت صحيح قطر هاله هاي عدم رشد
عمليات اصلاحي اضافي:
وقتي عمليات اصلاحي فوري مشکل را حل نکرد، احتمالا" خطاي مشاهده شده بعلت بروز يك اشکال کلي در سيستم و نه يک خطاي تصادفي ايجاد شده است. در اين حالت بايد موارد بيشتري بررسي شوند. مانند:
اندازه گيري و ثبت صحيح قطر هاله هاي عدم رشد
رعايت تاريخ انقضا و شرايط نگهداري ديسکها و مواد مورد استفاده (دور از رطوبت و در دماي مناسب)
Dr. S. S. Khoramrooz

39. مناسب بودن دما و اتمسفر انکوباتور
تغييرنيافتن يا آلوده نبودن سويه هاي کنترل
مطابقت صحيح سوسپانسيون تلقيح با استاندارد نيم مک فارلند
استفاده از پليت کشت تازه برای تلقيح (پليت کشت بايد تازه بوده و مدت زمان انكوباسيون آن بيشتر از 24 ساعت نباشد)
وقتي مشکل بر طرف شد، می‌توان کنترل کيفي هفتگي را برقرار کرد.
Dr. S. S. Khoramrooz

40. نگهداري ديسکهاي آنتي بيوتيکي
- ديسکها بايد در يخچال˚C 8 و پايين تر ، يا در فريزر˚C 14- و پايين تر تا زمان مصرف نگهداري شوند.
- تمامي ديسکهاي گروه بتالاکتام مانند پني سيلين، آمپي سيلين، کربني سيلين، تيکارسيلين، اگزاسيلين و نسل اول، دوم و سوم سفالوسپورين ها و ... بايد در فريزر نگهداري شوند، و فقط مي توان مقداري از آن را بر اساس کار روزانه آزمايشگاه حداکثر به مدت يک هفته در يخچال نگهداري نمود.
- بعضي آنتي بيوتيکهاي حساس مثل ايميپنم ، سفاکلر و ترکيبات کلاولانيک اسيد يا سولباکتام اگر تا هنگام مصرف در فريزر نگهداري شوند، پايداري بيشتري خواهند داشت.
- ديسکها بايد در ظروف داراي درپوش محکم و حاوي مواد جاذب رطوبت نگهداري شوند.
- ديسکهای آنتي بيوتيکي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از يخچال يا فريزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند.
Dr. S. S. Khoramrooz

41. Detection Strategy: step 1
Screen Enterobacteriaceae with :
Cefpodoxime- best general ESBL substrate
Cefotaxime & ceftazidime- good substrates for CTX-M & TEM/SHV, respectively
Dr.T.V.Rao MD

42. Combination disk method Carter MW et al: J Clin Microbiol 2000; 38: 4228 - 4232
Difference > 5 mm
Dr.T.V.Rao MD

43. ESBL Confirmatory Test
Positive for ESBL
Cefotax/CA
Ceftaz/CA
Ceftaz
Cefotax 43
Dr.T.V.Rao MD
jhindler nltn MW tele #

44. روش شناسایی استافیلوکوکوس مقاوم به متی سیلین
مولر هینتون همراه با 2% نمک
دیسک اگزاسیلین 1 میکروگرمی
Dr. S. S. Khoramrooz

45. پايان
Dr. S. S. Khoramrooz