1. Blood Group reagent evaluation
Dr.Atoosa Shariat Torbaghani
Reference Health Laboratory

2. Universal precautions
HIV
HBV

3. Appearance NO……. hemolysis Precipitate Particle Gel-formation
………………… in inspection

4. Contamination Culture must be negative
Using validate process to produce
Preservative
Sterile filter

5. Anti A & B potency Testing Prepare new saline contain 1-2% albumin
Two fold dilution of reagent with saline- one tube neg after it( 1/512)
Wash cells -at least twice
2% suspension RBC with saline(A cell & B cell)
0.1 ml serum dilution+0.1ml RBC (10*75 mm tube)
Shake gently
Incubate 5 min at RT(20-30c)
Centrifuge (15 sec /1000 g )
and grade (1+ to 4+)
The greatest dilution which gives 1+ agglutination(small clumps macroscopically)

6. Anti A & B Acceptable 1/128  A1 , B , A 1B 1/64  A 2 B , A 2
Or = Reference Reagent

7. بررسی Potency
برای رقیق سازی باید از لوله ای شروع کرد که آنتی سرم رقیق نشده و سپس با رقیق سازی 12/1 ، 4/1 ، 8/ ادامه داد.
برای رقیق سازی، از سالین ایزوتونیک حاوی آلبومین 2-1 % استفاده شود.
لوله آزمایش75 mm 12× یا بزرگتر به کار برید
تیتراسیون را تا جائی که به نتیجه منفی برسید ادامه دهید
تیتراسیون را با آنتی سرم رفرانس به طور همزمان ، مطابق روشی یکسان انجام دهید
برای جلوگیری از carry over بهتر است سر سمپلرها را برای هر رقت ، تعویض نمائید.
جهت کنترل ایزوتون ، آخرین لوله را با ایزوتون بدون آنتی سرم پر نمائید.

8. تهیه سوسپانسیون گلبول قرمز
در صورت استفاده از سلول منجمد ، روش کار دقیقی برای فریز کردن و ذخیره کردن و آب کردن و مصرف مجدد آن، تهیه گردد.همچنین بعد از آب شدن ، روشی برای کنترل کیفیت سلولهای قرمز تدوین گردد.
گلبولهای قرمز را حداقل دو بار با سالین شستشو دهید .( تا حدی که مایع رویی شفاف گردد)
سوسپانسیون 2% از سلول pack شده با سالین حاوی 2-1% آلبومین تهیه کنید.

9. حداقل سلولهائی که برای آزمایش potency لازم میباشد
Reagent
Red Blood Cells
Anti-A
A1 and 3 different A2B *
Anti-B
A1 and A1B
Anti-A,B
A1 and A2** and B
*سلول A2B یعنی سلول AB که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد
**سلول A یعنی سلول A که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد

10. روش انجام کار برای بررسی potency
1 میلی لیتر از معرف آنتی سرم را در لوله آزمایش ریخته و رقت سریال تهیه کنید طوری که در هر لوله آزمایش 0.1 میلی لیتر آنتی سرم باشد
0.1 میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی ( محلول 2% گلبول قرمز که با ایزوتون حاوی 2% آلبومین تهیه شده) را به هر لوله اضافه کنید
محتویات لوله ها را به خوبی مخلوط کنید. 5 دقیقه در حرارت اطاق ( درجه سانتیگراد) انکوبه کرده سپس با دور rpm 1000( rcf) به مدت یک دقیقه و یا 3400 rpm به مدت 15 ثانیه ( rcf ) سانتریفوژ کنید

11. نحوه تفسیر نتایج
سلول ته لوله را به آرامی تکان دهید تا جدا شود و ماکروسکوپی بررسی نمائید.
واکنش را به روش زیر درجه بندی نمائید:
توده سلولی به صورت یک تکه باقی بماند.
توده سلولی به چند قطعه بزرگ خرد شود
+2 توده سلولی به چندین قطعه کوچک مساوی خرد شود
+1 توده سلولی به ذرات ریز قابل مشاهده خرد شود
.D توده سلولی به ذرات ریز غیر قابل مشخص خرد شده است. برای درجه بندی این آزما یش خاص بهتر است موارد مشکوک را منفی گزارش کنید.
واکنش منفی به مواردی اطلاق میشود که توده سلولی طوری باز شود که کلامپ سلولی دیده نشود
آخرین لوله ای که واکنش +1 دارد به عنوان تیتر potency در نظر گرفته شود
رقیق سازی تا حداقل ، یک لوله بعد از endpoint ادامه داشته باشد
لوله آنتی سرم بدون سلول باید منفی شود.

12. ارزش تیتر بدست آمده
آنتی سرم های ABO حد اقل تیتری مساوی تیتر آنتی سرم رفرانس داشته باشد

13. FDA & WHO
برای anti-A از استاندارد 03/188 با رقت 1/8 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد
برای anti-B از استاندارد 03/164 با رقت 1/4 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد

14. Anti A & B
Avidity(BOB)
10% saline suspension of A&B cell (once washed)
100λ cell+100λ serum(slide area 25mm)
Time record beginning agglutination(T<25˚C)
Serum Cell beginning time(seconds)
Anti-A A A
A1B
A2B
Anti-B B
Macroscopic clump(1mm2) before 3 minutes

15. بررسی Avidity
رقت 2/1 را با مخلوط کردن مقادیر مساوی آنتی سرم مورد آزمایش و سرم AB که فاقد آنتی بادی میباشد و یا با هر رقیق کننده ای که سازنده توصیه کند ، تهیه کنید
گلبول قرمز را سازنده ، مطابق روشهای خود تهیه کند

16. حداقل سلولهائی که برای آزمایش Avidity لازم میباشد
Reagent
Red Blood Cells
Anti-A
A1 and A2B *
Anti-B
B and A1B
Anti-A.B
A1 , A2 ** , B , and Ax***
*سلول A2B یعنی سلول AB که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد
**سلول A یعنی سلول A که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد
*** سلول Ax یعنی سلول variant A در صورتیکه سازنده توصیه کرده آنتی سرمش با سلول A ضعیف هم واکنش دارد

17. انجام آزمایش
آزمایش را با آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده به روش اسلاید انجام دهید.
نتیجه آزمایش را در زمان ادعا شده توسط سازنده و همچنین در نصف زمان فوق ، یادداشت کنید.

18. نتایج آزمایش :
نشانه های آگلوتیناسیون، در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده درپایان نیمه اول زمان واکنش ( که توسط سازنده ادعا شده بود )باید مشاهده شود.
آگلوتیناسیون واضح ،در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده، درپایان زمان واکنش ، به صورت توده کمتر و یا بزرگتر از یک میلیمتر گزارش گردد

19. Anti A & B Specificity Anti-A A1-A2B(3) Anti-B A1B(3)-B Anti-AB
Confirm reaction with A,B,AB
At least 2+ reaction
B Confirm absence of reaction with panel cell due to Ab contamination D,C,E,c,e,cw,k,R,Kpa,Kpb,Fy,Fyb,Lub,Lua,JKa,JKb,M,N,S,s,PI,Xgaا
Anti-A
A1-A2B(3)
Anti-B
A1B(3)-B
Anti-AB
A1(3)-B(4)-A2(2)-Ax(3)

20. آزمایش Specificity نباید آنتی سرم را رقیق کرد
حد اکثر 7 روز از زمان خونگیری گذشته باشد
آزمایش تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن
آزمایش جهت تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها

21. تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن
حداقل از 4 اهداکننده ، خون جمع آوری شود
برای هر آنتی سرم به طور جداگانه سلول تهیه شود
در هر سری کاری حد اقل یک سلول قرمز فاقد آنتیژن مربوطه، به عنوان کنترل منفی آزمایش شود.

22. حداقل سلولهائی که برای آزمایش specificity لازم میباشد
Red Blood Cells
Reagent
A1 (1) and A2B (3)*
Anti-A
A1B (3) and B (1)
Anti-B
A1 (2) and A2 (2) ** and
B (4) And
at least 3 different Ax***
Anti-A,B

23. تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها
تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها
آنتی سرم را با سلول های زیر مجاور کرده و آزمایش کنید:
A, B, H, Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb ,Pi , D , C , E , c , e , Cw , M , N , S , s , U , Lua , Lub , JKa , JKb , Fya , Fyb , Xga , Doa , Dob , Yta , Ytb , Lan , Coa , Cob , Mg , Wra , Sda ,Vw
در صورتی که آنتی سرم منوکلونال بوده و این کلون قبلاً بررسی و تائید شده میتوان فهرست فوق را خلاصه تر کرد:
A , B , H , Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb, Pi , D , C , E , c , e , M , N , S , s , U , Lub, JKa , JKb , Fya , Fyb
حداقل از 4 اهداکننده ، خون جمع آوری شده و آزمایش مستقیم انجام شود.

24. نحوه تفسیر نتایج specificity
در هیچیک از واکنشها نباید همولیز و یا رولو دیده شود.
برای تائید حضور آنتی ژن ، واکنشهای مثبت باید حداقل 2 + باشد.اگر یکی از 4 خون مورد آزمایش ، واکنش کمتر از 2+ داشته باشد باید 4 خون دیگر را آزمایش کنید.در صورتیکه فقط یکی از این 8 آزمایش دارای واکنش کمتر از 2+ داشته باشد ، نتیجه را قابل قبول بشناسید.
مواردی که عدم حضور آنتی ژنها را بررسی میکنیم باید واکنشها منفی باشند

25. Anti-A & B False Agglutination(BOB)
10% saline suspension of cell Rh+(once washed with 0.15 M saline& Unwashed)
100λ cell +100λ serum
Mix two minutes (room temperature)
or(slide area 1×3 in.)
No agglutination, hemolysis, rouleaus
formation

26. آزمایش از نظر آگلوتیناسیون خود به خود
رقتهای آنتی سرم:
نیازی به رقیق سازی نمی باشد
آنتی سرم با سلول O منفی نباید واکنش آگلوتیناسیون ایجاد نماید
(سلول O منفی حاوی آنتی ژن c که توسط آنتی بادی Anti-c از نوع IgG پوشیده شده)

27. package & container Container Color of label paper Information
Lettering size
Visual inspection
Package label

28. stability control Minimum of 1% of each batch
Should be retained at least 6 months beyond expiry date

29. روش پیشنهادی مرکز ملی خون صلیب سرخ تایلند
روش پیشنهادی مرکز ملی خون صلیب سرخ تایلند

30. ارزيابي آنتي سرم گروه خوني
Anti-Rh

31. Universal precautions
HIV
HBV

32. Appearance NO……. hemolysis Precipitate Particle Gel-formation
………………… in inspection

33. Contamination Culture must be negative
Using validate process to produce
Preservative
Sterile filter

34. Anti-Rh(FDA) Titration 1+ > 1/16(FDA) , 1/32(BOB) Or = reference
Serial two fold dilution (anti-Rh)
2% suspension cell Rh+
100 anti-Rh + 100 cell
Incubation(One hour 37c)
Centrifuge(45 sec at 1000 g)
Reading & grading
1+ > 1/16(FDA) , 1/32(BOB)
Or = reference

35. Anti-Rh(BOB) Titer Two fold dilution serum in 20% albumin
“ “ “ “ salin
2% suspension RBC(Rh2) with albumin
“ “ “ salin
0.1 ml serum dilution+0.1 ml RBC
Incubate 37°C for 60 minutes
Centrifuge (2 minures at 1000 rpm)
[a control  albumin+RBC
“  erum dilution + RBC Rh negative]
Observe for agglutination
1+ > 1/32

36. بررسی Potency
برای رقیق سازی باید از لوله ای شروع کرد که آنتی سرم رقیق نشده و سپس با رقیق سازی 12/1 ، 4/1 ، 8/ ادامه داد.
برای رقیق سازی، از سالین ایزوتونیک حاوی آلبومین 2-1 % استفاده شود.
لوله آزمایش75 mm 12× یا بزرگتر به کار برید
تیتراسیون را تا جائی که به نتیجه منفی برسید ادامه دهید
تیتراسیون را با آنتی سرم رفرانس به طور همزمان ، مطابق روشی یکسان انجام دهید
برای جلوگیری از carry over بهتر است سر سمپلرها را برای هر رقت ، تعویض نمائید.
جهت کنترل ایزوتون ، آخرین لوله را با ایزوتون بدون آنتی سرم پر نمائید.

37. حداقل سلولهائی که برای آزمایش potency لازم میباشد
Reagent
Red Blood Cells
Anti-D
Dce ( R0r )
Anti-C
dCce ( r’ r )
Anti-E
dcEe ( r’’ r )
Anti-c
DCcEe ( R1 R2 )
Anti-e
DcEe ( r’’ r )
Anti-cd
dCce ( r’ r ) & DCe ( R2 r )
Anti-DE
Dce (R0 r ) & dcEe ( r’’ r )
Anti-CDE
dCce ( r’ r ) & Dce ( R2 r ) & dcEe ( r’’ r )

38. روش انجام کار برای بررسی potency
میلی لیتر از معرف آنتی سرم را در لوله آزمایش ریخته و رقت سریال تهیه کنید طوری که در هر لوله آزمایش 0.1 میلی لیتر آنتی سرم باشد
میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی ( محلول 2% گلبول قرمز که با ایزوتون حاوی 2% آلبومین تهیه شده) را به هر لوله اضافه کنید
محتویات لوله ها را به خوبی مخلوط کنید. 15 دقیقه در حرارت 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید
سپس با دور rpm 1000( rcf) به مدت دو دقیقه و یا 3400 rpm به مدت 45 ثانیه ( rcf ) سانتریفوژ کنید .

39. آخرین لوله ای که واکنش +1 دارد به عنوان تیتر potency در نظر گرفته شود
رقیق سازی تا حداقل ، یک لوله بعد از endpoint ادامه داشته باشد
لوله آنتی سرم بدون سلول باید منفی شود.
آنتی سرم های Rh حد اقل تیتری مساوی
تیتر آنتی سرم رفرانس داشته باشد

40. FDA & WHO
برای low protein anti-D از استاندارد 99/836 با رقت 1/3 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد
برای high protein anti-D از استاندارد 99/836 با رقت 1/8 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد

41. Anti Rh Specificity reaction With cell + Rh+ - Rh-
Confirm reaction with A,B,AB
At least 2+ reaction
B Confirm absence of reaction with panel cell due to Ab contamination D,C,E,c,e,cw,k,R,Kpa,Kpb,Fy,Fyb,Lub,Lua,JKa,JKb,M,N,S,s,PI,Xgaا
reaction
With cell +
Rh+ -
Rh-

42. آزمایش Specificity: نباید آنتی سرم را رقیق کرد
حد اکثر 7 روز از زمان خونگیری گذشته باشد
آزمایش تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن
آزمایش جهت تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها
آزمایش جهت تائید عدم حضور anti-A , anti-B

43. تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن
حداقل از 4 اهداکننده ، خون جمع آوری شود
به عنوان مثال برای بررسی anti-CDE حداقل 4 اهدا کننده برای جزئ anti-C و 4 خون برای anti-D و 4 خون برای anti-E به کار رود.
برای هر آنتی سرم به طور جداگانه سلول تهیه شود
در هر سری کاری حد اقل یک سلول قرمز فاقد آنتی ژن مربوطه، به عنوان کنترل منفی آزمایش شود.

44. تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها
آنتی سرم را با سلول های زیر مجاور کرده و آزمایش کنید:
A, B, H, Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb ,Pi , D , C , E , c , e , Cw , M , N , S , s , U , Lua , Lub , JKa , JKb , Fya , Fyb , Xga , Doa , Dob , Yta , Ytb , Lan , Coa , Cob , Mg , Wra , Sda ,Vw
در صورتی که آنتی سرم منوکلونال بوده و این کلون قبلاً بررسی و تائید شده میتوان فهرست فوق را خلاصه تر کرد:
A , B , H , Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb, Pi , D , C , E , c , e , M , N , S , s , U , Lub, JKa , JKb , Fya , Fyb

45. آزمایش جهت تائید عدم حضور anti-A , anti-B
از گلبولهای قرمز حاوی آنتی ژن A1 و B که فاقد آنتی ژنهای D باشد استفاده کنید.
( از گلبول A1B می توان نیز استفاده کرد. )

46. نحوه تفسیر نتایجspecificity
در هیچیک از واکنشها نباید همولیز و یا رولو دیده شود.
برای تائید حضور آنتی ژن ، واکنشهای مثبت باید حداقل 2 + باشد.اگر یکی از 4 خون مورد آزمایش ، واکنش کمتر از 2+ داشته باشد باید 4 خون دیگر را آزمایش کنید.در صورتیکه فقط یکی از این 8 آزمایش دارای واکنش کمتر از 2+ داشته باشد ، نتیجه را قابل قبول بشناسید.
کنترل منفی ، باید واکنش منفی نشان دهد.
مواردی که عدم حضور آنتی ژنها را بررسی میکنیم باید واکنشها منفی باشند.

47. Anti-Rh
Avidity (BOB)
40% suspension RBC RH positive in their own plasma or serum, or in AB plasma or serum
100λ cell + 50 λ serum (slide area 20*40)
Place on illuminated glass ( T<47 °C)
The end of 2 minutes record size of clump
Beginning before 60 seconds
Clump at least 1mm/2 min
RBC  Dce(Rh1) / Dce(Rh0) / DcE(Rh2)

48. بررسی Avidity
رقت 2/1 را با مخلوط کردن مقادیر مساوی آنتی سرم مورد آزمایش و سرم AB که فاقد آنتی بادی میباشد و یا با هر رقیق کننده ای که سازنده توصیه کند ، تهیه کنید
گلبول قرمز را سازنده ، مطابق روشهای خود تهیه کند

49. حداقل سلولهائی که برای آزمایش Avidity لازم میباشد:
Reagent
Red Blood Cells
Anti-D
DCe ( R1 r )
Anti-C
dCce ( r’ r )
Anti-E
dcEe ( r’’ r )
Anti-c
Anti-e
Anti-CD
Dce ( R0 r ) & dCce ( r’ r )
Anti-DE
Dce ( R0 r ) & dcEe ( r’’ r )
Anti-CDE
Dce (R0 r ) & dcEe ( r’’ r )

50. انجام آزمایش:
آزمایش را با آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده به روش اسلاید انجام دهید.
نتیجه آزمایش را در زمان ادعا شده توسط سازنده و همچنین در نصف زمان فوق ، یادداشت کنید
نشانه های آگلوتیناسیون، در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده درپایان نیمه اول زمان واکنش ( که توسط سازنده ادعا شده بود )باید مشاهده شود.
آگلوتیناسیون واضح ،در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده، درپایان زمان واکنش ، به صورت توده کمتر و یا بزرگتر از یک میلیمتر گزارش گردد.

51. آزمایش پدیده پروزون نباید آنتی سرم را رقیق کرد
حد اقل سه نمونه خون با سه فنوتیپ مختلف Rh تهیه کنید
حد اکثر 7 روز از زمان خونگیری گذشته باشد
آزمایش آنتی گلوبین مستقیم انجام دهید و مطمئن شوید سلولهای قرمز پوشیده از آنتی بادی نمی باشند.
سلولها را حداقل دو بار با سالین شستشو دهید تا مایع روئی شفاف شود

52. سلولهای پیشنهادی برای آزمایش پروزون
Reagent
Red Blood Cells
Anti-D
DCce ( R1 r )
Anti-C
DCcEe ( R1 R2 )
Anti-E
Anti-c
DCce ( R1 r ) & DCcEe ( R1 R2 )
Anti-e
DcEe ( R2 r ) & DCcEe ( R1 R2 )

53. انجام آزمایش
برای هر سلول ، سه لوله آزمایش آماده کنید. روی هر کدام برچسب 15 دقیقه – دقیقه – 60 دقیقه بزنید
مقادیر مناسبی از آنتی سرم را در هر لوله بریزید.
به هر لوله سلول اضافه کنید
آنها را مخلوط کرده و هر یک را طبق برچسب ، انکوبه در دمای مناسب انکوبه کنید
طبق روش بروشور ، سانتریفوژ کنید

54. -اگر درجه واکنش در هر سه لوله یکسان است و یا به ندریج واکنش بیشتر شده ، پدیده پروزون وجود ندارد
-در صورتیکه با افزایش زمان انکوباسیون ، میزان واکنش کاهش نشان بدهد ، پروزون وجود دارد
حداقل واکنش +2 در تمامی لوله ها باید مشاهده شود

55. روش دوم برای آزمایش پروزون
روش دوم برای آزمایش پروزون
دو سری لوله ( در هر سری 5 لوله ) آماده کنید.
برچسب 1 ثانیه – 1 دقیقه -3 دقیقه – 5 دقیقه – 10 دقیقه روی هر سری از لوله ها بزنید
در یک سری از لوله ها آنتی سرم رقیق شده و در سری دوم آنتی سرم رقیق شده بریزید
به هر لوله مقدار مناسبی سوسپانسیون سلولی اضافه کنید
مخلوط کرده و در دمای منا سب ، طبق برچسبها ، انکوبه کنید
طبق بروشور سانتریفوژ کنید
اگر درجه واکنش در لئله های رقیق شده قویتر از لوله های رقیق نشده بود ، پدیده پروزون وجود دارد
اگر درجه واکنش در لوه های رقیق شده مساوی و یا ضعیفتر از لوله های رقیق نشده بود ، پروزون وجود ندارد.

56. Anti-Rh(BOB) Three test tube (0.25 ml serum)
false agglutination
Three test tube (0.25 ml serum)
0.25ml (2% cell suspension once washed AB-
Incubate  37°C (1 hour)  RT( 2 hour) °C ( “ )  “
RT( 3 hour)
No agglutination, hemolysis, rouleaux formation

57. Anti Rh
6-Reaction with Du+
Antihuman Globulin test

58. stability control Minimum of 1% of each batch
Should be retained at least 6 months beyond expiry date

59. package & container Container Color of label paper Information
Lettering size
Visual inspection
Package label

60. روش پیشنهادی مرکز ملی خون صلیب سرخ تایلند
روش پیشنهادی مرکز ملی خون صلیب سرخ تایلند

61. THE END