1. genetička epidemiologija populaciona genomika -dizajn studija-

2. neka pitanja populacione genetike
Šta nam DNK sekvenca govori o istoriji populacija?
Kako su evolutivni faktori oblikovali genetičku raznovrsnost i diferencijaciju populacija?
Ima li asocijacije izmedju varijabilnosti u DNK sekvencama i fenotipa?

4. Genetička epidemiologija – istražuje ulogu genetičkih faktora u ispoljavanju osobina u porodicama i populacijama i interakcije genetičkih faktora sa sredinskim
ispitati uzročnu medjusobnu vezu više gena, gena i sredinskih faktora sa fenotipom
napraviti najbolji dizajn studije

5. Ima li značajne porodične agregacije fenotipa
Osnovno pitanje: da li je, i u kom stepenu, variranje složenog fenotipa (Vf) pod genetičkom kontrolom (Vg)?
Primer: identifikovati genetičke faktore kod domaćina koji doprinose riziku za infektivno oboljenje
Ima li značajne porodične agregacije fenotipa
ako ima značajne asocijacije medju rodjacima za neko oboljenje, a ne javlja se medju supružnicima, znači visoka je Vg (genetička varijansa, npr. za infekciju nekim patogenom) i ne može se pripisati zajedničkoj sredini kojom se prenosi infekcija

6. Složene osobine..monogeno determinisane, poligeno, interakcija gena i sredine

7. Multifactorial Etiology
ROCHE Genetic Education (www)

9. Prelaz sa studija familija na populacione studije...
Porodične studije vezanosti (linkage)
mere ko-segregaciju u familijama, malim rodoslovima
ne treba kontrolna grupa jer testiraju specifični model mendelovske segregacije unutar familije
Populacione studije asocijacija
mere ko-segregaciju u populacijama
koriste neravnotežu vezanosti (LD) koja se među populacijama razlikuje

10. Linkage - studije vezanosti
Genomika i složene osobine: da li je marker na hromozomu blisko lociran – “vezan” za nepoznati region koji kontroliše fenotip?
Linkage - studije vezanosti
upotrebom molekularnih markera
otkrivanje lokusa za kvantitativne osobine (QTL)
obično je puno sekvenci (npr. STR) asociranih sa fenotipom i imaju plejotropni efekat, uz epistaze, uticaj pola, populaciono specifični su itd.
Studije asocijacije
WGAS (Whole Genome Association Studies)
nekoliko hiljada SNPs, treba da obuhvati veliki uzorak sa osobinom i kontrole bez date osobine
GEIS (Gene-Environment Interaction Studies)
kako genotipovi u specifičnoj sredini menjaju fenotip
GWIS (Genome - Wide Interaction Studies)

11. Relativni rizik parametar genetičke epidemiologije
PAR – population attributable risk
Proporcija slučajeva koja se pripisuje odredjenom faktoru rizika
(za koliko bi opala incidenca kancera pluća da niko nije pušač?)
PAF – population attributable fraction
Proporcija svih slučajeva u populaciji koja je izložena tom faktoru rizika
(koja frakcija obolelih od kancera pluća su pušači?)
PAR i PAF se suštinski razlikuju samo ako je izloženost riziku česta a efekat varijanti relativno slab
za retke izloženosti i varijante sa jakim efektom mala je razlika

12. Relativni rizik genotipa
Markeri DNK polimorfizma (mikrosateliti, SNP) daju informaciju o genotipovima u kontrolnim uzorcima i u “slučajevima”
RR (relativni rizik za dati genotip) (GRR) = fd(1-fc)/fc(1-fd)
fc, fd, su učestalosti genotipova u kontrolnoj i grupi “slučajeva”
Dobijeni GRR se testira u odnosu na neki od modela
Poredjenje: osobe koje imaju alel niskorizični (npr. d) odnosno visokorizični (npr.D) alel na oba, jednom ili nijednom hromozomu
Ako su p0, p1, p2 verovatnoće oboljevanja osoba sa 0, 1, ili 2 kopije rizičnog alela D, onda su modeli GRR:
Multiplikativni
GRR = p1 / p0 = p2 / fp
Aditivni
GRR = p1 / p0
Dominantni
GRR = p1 / p0 = p2 / p0
Recesivni
GRR = p2 / p0 = p2 / p1
Opšta prevalenca oboljenja je (p2Rdd+2pqRDd+q2RDD)

13. Relativni rizik porodični da li se odredjene varijante grupišu u porodicama
učestalost medju rodjacima obolelog
λr =
populaciona učestalost
λ je rizik ponavljanja medju srodnicima
r je tip srodstva - u odnosu na konkordantno nasledjivanje kod parova srodnika koji su sa datom osobinom - analogno koeficijentu heritabilnosti
Genetičko mapiranje je lakše za osobine sa visokom vrednošću λ ,
(λ > 10) nego sa niskom (λ < 2).

14. sve te relacije pomažu u razvoju strategije istraživanja i mapiranja
za dati porodični rizik λ, različiti modeli mogu biti i sa različitim PAR
nema odredjene korespodencije λ i PAR
retki aleli (npr. p=0,0001) visokog rizika (npr. R=50, DOM model), asocirani sa više porodičnih kancerskih sindroma (npr. λ=1,05), javljaju se u maloj proporciji u populaciji (npr. PAR=1%)
sve te relacije pomažu u razvoju strategije istraživanja i mapiranja
Primer:
kancer dojke, porodična istorija, skrining mutacija u populacionim case-control studijama u UK procenila da je samo 17% porodičnog rizika usled visoko penetrabilnih BRCA1 i BRCA2.
ako preptostavimo da su ostali, nisko penetrabilni lokusi relativno visoke učestalosti u populaciji ali im je efekat mali (niskorizični SNPs), tada ne više od 15% njih bi objasnilo ostatak-udeo u porodičnom riziku preptostavivši MULT model.
verovatnoća da će slučajno uzeti SNPs u genomu biti asocirani sa kancerom dojke je tada veoma mala i potrebno je uključiti veliki uzorak da bi se postigla pouzdanost u detektovanju lokusa sa tako malim efektom

15. populacione studije kombinuju geneologiju i baze podataka
u proceni λ
populacione studije kombinuju geneologiju i baze podataka
dve velike baze, Juta (SAD) i Švedska
procenjuju porodični rizik za skoro sve kancere
drugi pristup odredjivanja relativnog doprinosa Vg kanceru u populaciji koristi MZ i DZ parove blizanaca u proceni
broj parova u kojima oboje obole u poredjenju sa parovima kod kojih samo 1 oboli
model podrazumeva aditivni doprinos brojnih lokusa koji doprinose podložnosti i kada ona predje prag, ispolji se fenotip
ne može se razlikovati efekat dominanse i zajedničke sredine
Primer: Skandinavija, uzorak od parova blizanaca, linkage studije kancera
Oba pristupa su dala neke sličnosti: identifikovale su da kancer prostate i kolona ima značajnu Vg, nijedna nije našla značajnu Vg za kancer uterusa
Retke varijante ne daju značajnu porodičnu grupisanost na nivou populacije

16. Populacione studije asocijacija
mere ko-segregaciju u populacijama
koriste neravnotežu vezanosti (LD) koja se među populacijama razlikuje

17. Populacione studije asocijacije
zasnovane su na poredjenju nesrodnih jedinki u populaciji koje imaju poremećaj, određeni (fenotip) sa jedinkama bez njega
Neki alel se smatra asociran sa osobinom ako je učestaliji medju obolelim jedinkama
Moguće su ovakve studije za bilo koji DNK polimorfizam, ali imaju najviše smisla za funkcionalno značajne varijante
Genome Wide Association Studies asocijacije širom genoma
Identifikuju SNPs koji ili imaju fenotipski efekat ili su u bliskoj vezanosti (LD) sa lokusom koji ima efekat.

18. Razlike izmedju studija linkage i asocijacije
vezanost
asocijacija
svojstvo lokusa i genetički je fenomen
svojstvo alela i statistički je fenomen
uloga:
Identifikovati biološki mehanizam prenosa osobine ilocirati gen
Identifikovati asocijaciju izmedju alela i pojave osobine
Identifikovati LD izmedju alela za osobinu i marker alela
Grubo mapiranje (>1cM)
Fino mapiranje (<1cM)
Ne daje info o tome koja alelska varijanta je značajnije povezana s arizikom za nastanak poremećaja
 daje informaciju o riziku
Zahteva rodoslove
Pristup je preko grupa kontrola i slučajeva ili populacionih grupa
Markeri su veoma polimorfni
Markeri su obično bialelni

19. Najveći problem je odabir kontrolne grupe
Asocijacija nije genetički već statistički fenomen koji odredjuje zajedničko javljanje alela i fenotipa
Npr. Ako je u opštoj populaciji učestalost alela HLA-DR4 36%, a kod obolelih od reumatodinog artitisa 78%, tada smatramo da je taj alel statistički asociran sa RA tj.nosi relativni rizik
Najveći problem je odabir kontrolne grupe

20. “Case-Control” studije asocijacije sa nesrodnim kontrolama
uobičajene u epidemiologiji
uzorak slučajeva
uzorak kontrola iz iste populacije sa sličnom genetičkom pozadinom (poreklom)
The numbers in this example are taken from a 2007 study of coronary artery disease (CAD)
which showed that the individuals with the G-allele of SNP1 (rs ) were overrepresented
amongst CAD-patients.

21. ako alel A uzrokuje osobinu
pozitivna asocijacija nekog alela npr. A i osobine može nastati iz više razloga:
ako alel A uzrokuje osobinu
u tom slučaju isto se mora dobiti u svim ispitivanim populacijama
ako alel A ne uzrokuje osobinu, ali je u neravnoteži vezanosti (LD) sa stvarnim uzročnikom
ako je osobina nastala usled odvojenih predačkih mutacija na uzrokujućem lokusu, a alel A bio prisutan na nekom od tih predačkih hromozoma dovoljno blizu
ako je posledica artefakta usled mešanja populacija
u mešovitoj populaciji, svaka osobina u visokoj učestalosti u nekoj etničkoj grupi pokazaće pozitivnu asocijaciju sa bilo kojim alelom koji je učestaliji u toj grupi NAJVEĆI I NAJČEŠĆI PROBLEM
San Francisco...asocojacija izmedju nosilaca alela A1 na HLA lokusu i sposobnosti upotrebe štapića za jelo..HLA*A1 je učestaliji medju kinezima nego kavkazijancima

22. Kod složenih fenotipova, većina je čestih i umereno čestih varijanti sa niskim ili umerenim efektom
GWAS pristup ih može detektovati
Retke varijante u opštoj populaciji sa velikim efektom, obično su populaciono-specfične (BRCA1/2)

23. Published Genome-Wide Associations through 12/2013
Published GWA at p≤5X10-8 for 17 trait categories
NHGRI GWA Catalog
Credit: D Leja and T Manolio, NHGRI; T Burdett, D Welter, and H Parkinson, EBI

24. 2007, Wellcome, Trust Case Control Consortium, 500 000 SNP, kod 17 000 osoba, 7 oboljenja
označene su najjače asocijacije pojedinih hromozoma sa oboljenjem
sledeći korak je da se utvrdi da li je taj deo uzročnik oboljenja ili je samo u LD sa uzročnikom

25. Nedostaci
mešane populacije ili stratifikacija populacija usled čega se kontrole i uzorci razlikuju u učestalosti alela jer nisu istog populacionog porekla
to može dovesti do lažno-pozitivnih ili lažno-negativnih asocijacija
potreban veliki uzorak da bi se detektovale interakcije sa sredinom i to ≥ 4 puta više ukoliko su zajedničke genetičke i sredinske varijable

26. Population Stratification
Marchini, 2004 (www)

27. I dalje..“missing heritability“..“dark matter“
Identifikovane asocirane varijante i ne objašnjavaju u potpunosti porodični relativni rizik za nastanak oboljenja
mogući kandidati bi bili aleli sa nepotpunom penetrabilnošću, retke varijante, CNV, epigenetičke studije...
Poredjenje rezultata porodičnih studija vezanosti i studija asocijacije daju nisko podudaranje
mogući razlozi su interakcije GS, epistaze, genetička i populaciona heterogenost...

28. Studija 90 000 blizanaca Švedska, Danska, Finska:
statistički značajni udeo Vg u Vf samo za kancer prostate (42%), kolorektalni (35%) i dojke (27%
Studija 9,6 miliona osoba u Švedskoj bazi podataka porodičnih kancera:
udeo Vg najveći za kancer štitaste žlezde (53%), visoka heritabilnost za kancer endokrinog sistema (28%), testisa (25%), dojke (25%) i melanom (20%).
Galvan et at Beyond GWAS: genetic heterogeneity and individual predispozition to cancer. Trends in genetics, 26:

29. Neki primeri..
Kancer dojke i kolorektalni kancer:
puno lokusa poznato, ali ostaje nepoznatih dosta koji doprinose Vg verovatno putem kombinacije učestalih alela niske penetrabilnosti, koji interaguju i sa sredinom
Kancer pluća, kancer grlića materice:
malo lokusa poznato, niska h2
primer veće značajnosti sredinskih faktora (nikotin, HPV)
Kancer štitaste žlezde: malo lokusa poznato visoka h2

30. Dosta je kontroverzi oko označavanja populacija po etničkoj pripadnosti, poreklu u cilju zdravlja
alelske učestalosti oslikavaju populacionu strukturu, genetičku vairjabilnost, istorijske faktore-drift, protok gena i odražavaju se na diferencijaciju populacija, subpopulacija
neki aleli koji se smatraju zajedničkim za doprinos riziku teško će se naći u malim populacijama ako su retki
neki aleli su specifični za subpopulacije
neke varijante mogu u različitim sredinama imati različite efekte

31. Genetički rizik za nastanak kancera se razlikuje medju populacijama
USA: visoka incidenca kolorektalnog kancera medju migrantima japanskog ali ne i Latino porekla, a u obe populacije je niska stopa oboljevanja od ovog tipa kancera (preovljadjuje interakcija sa Vs)
Nema razlike kada se radi o kancerima koji se ospoljavaju u mladjem dobu (preovladjuje Vg)
GWAS kancera su radjene uglavnom na populacijama evropskog porekla i identifikovale brojne učestale varijante koje doprinose niskom riziku, ali ograničenja su u kliničkoj primeni, u predikciji rizika
identifikovane varijante za učestale kancere objašnjavaju samo 25% heritabilnosti
Haiman&Stram Exploring genetic susceptibility to cancer in diverse populations. Current Opinion in Genetics & Development. 20:1–6.
Goldgar, Population genetics of cancer. Biochimie 84:19-25.

32. Genome Wide Association Studies asocijacije širom genoma
Identifikuju SNPs koji ili uzrokuju ili su u LD sa uzročnikom poremećaja (fenotipa)
Studije asocijacije zavise od neravnoteže vezanosti
usled efekta genetičke vezanosti alela
bliski SNP nisu i nezavisni

33. Neravnoteža vezanosti (linkage disequilibrium – LD)
odnosi se na alele u populacijama
ako se 2 alela nasledjuju zajedno češće nego što se očekuje mendelovski, kaže se da su u neravnoteži vezanosti
Gametska neravnoteža, se odnosi i na alele na različitim hromozomima, koji segregiraju u gamete
To je odstupanje od slučajne asocijacije alela u haplotipovima od očekivane na osnovu učestalosti alela na 2 i više nezavisnih, udaljenih lokusa

34. Gametska ravnoteža (gametski ekvilibrijum)
(n - broj alela; m - broj lokusa; svaki lokus ima isti broj alela;
nm = broj alelskih kombinacija u gametima)
učestalosti alela i gameta za dvoalelni, dvolokusni model
jednake su proizvodu učestalosti alela koje sadrže
_______________________________________________
Aleli učestalost Gameti učestalost
A p A1B pr = g1
A q A1B ps = g2
B r A2B qr = g3
B s A2B qs = g4

35. gameti ženki g1 (A1B1) g2 (A1B2) g3 (A2B1) g4 (A2B2)
gameti mužjaka
g1 (A1B1) g1g g2g g3g g4g1
g2 (A1B2) g1g g2g g3g g4g2
g3 (A2B1) g1g g2g g3g g4g3
g4 (A2B2) g1g g2g g3g g4g4
Spajanjem gameta putem slobodnog kombinovanja može nastati 16 različitih diploidnih kombinacija alela, tj. genotipova (pr+ps+qr+qs)2
Genotipovi učestalosti (pr + ps + gr + gs)
A1B1 / A1B g12
A1B1 / A1B g1g2
A1B1 / A2B g1g3
A1B2 / A1B g22
A1B1 / A2B g1g4
A1B2 / A2B g2g3
A1B2 / A2B g2g4
A2B1 / A2B g32
A2B1 / A2B g3g4
A2B2 / A2B g42
Ravnotežne učestalosti genotipova za par dvoalelnih lokusa
Očekuje se da su učestalosti alela u nespregnutim gametima jednake učestalostima odgovarajućih alela u spregnutim gametima, i da time proizvodi učestalosti oba tipa gameta budu jednake:
A1B2 x A2B1 = A1B1 x A2B2.

36. SNP1 [ A1 / A2 ] SNP2 [ B1 / B2 ] p(A1) p(B1) p(A2) p(B2)
Nezavisno segregirajući SNPs:
Očekivana učestalost haplotipa p(A1B1) = p(A1) x p(B1)
NERAVNOTEŽA VEZANOSTI
učestalost haplotipa p(A1B1)≠ p(A1) x p(B1)
Haplotip se prvo mora odrediti genotipovima gametske faze –moraju se znati genotipovi roditelja, ili se računaju preko Max verovatnoće 36

37. D = p(A,C) p(G,T) - p(A,T) p(G,C)
Lokusi su u ravnoteži vezanosti ako je
p(A,C) = p(A) x p(C)
Neravnoteža je ako:
All based on Lewontin's D
Performance depends on recombination fraction, allele frequency and other parameters
Overall D’ and d are the best, although performance decreases if marker and disease loci are close.
D = p(A,C) - p(A) x p(C)
D = p(A,C) p(G,T) - p(A,T) p(G,C) 37

38. Rekombinacije smanjuju LD
Interes za LD raste naglo ’80tih zbog mapiranja genoma LD se detektuje za puno bliže markere nego u studijama vezanosti
Rekombinacije smanjuju LD
što su markeri (aleli) bliže, jači je LD jer je niža stopa rekombinacije
učestalost haplotipa usled neravnoteže je:
p(A1B1)≠ p(A1) x p(B1) + D (-D)

39. U populaciji, rekombinacijama...
Nakon 20 generacija mejoza, zajednički regioni će se smanjiti u odnosu na predački, samo će blisko vezani ostati zajedno
Ako su dve nesrodne osobe nasledile alel D za oboljenje od davnog zajedničkog pretka, tada će one imati i isti alel blisko lociran sa D
Informaciju daje postojeće populaciona asocijacija izmedju alela D i markera:
Odredjene kombinacije blisko vezanih alela javljaće se češće

40. lokus M (aleli M1, M2 - neutralni markeri, SNPs)
Ako ne znamo ništa o jednom lokusu, možemo saznati pomoću drugog…
SNP može biti u asocijaciji sa osobinom iako nije uzročni ali je statistički korelisan sa nekom uzročnom varijantom, usled LD
Ex:
lokus M (aleli M1, M2 - neutralni markeri, SNPs)
lokus B (alel B1 u odnosu na B2 povećava rizik za npr. kancer)
Očekujemo da je učestalost B1 povišena u uzorku “slučajeva” u odnosu na kontrolnu grupu
Ako su M i B lokusi u LD, onda se M1 nalazi češće sa B1 nego sa B2, pa nije samo B1 povišene učestalosti kod “slučajeva” nego i M1

41. asocijacije mogu biti suprotnosmerne u različitim populacijama
pozitivne asocijacije usled LD mogu dati naizgled kontradiktorne rezultate:
pozitivna asocijacija alela A i neke osobine u populacionim studijama može nastati
ako alel A ne uzrokuje osobinu, ali je u LD sa stvarnim uzročnikom.
ako je osobina nastala usled odvojenih predačkih mutacija na uzrokujućem lokusu, a alel A bio prisutan na nekom od tih predačkih hromozoma dovoljno blizu
asocijacije mogu biti suprotnosmerne u različitim populacijama

42. Unutar porodice, linkage se dešava kada dva markera, mesta na hromozomu ostanu zajedno, ne razdvoje se rekombinacijom u mejozi
U populaciji delovi osnivačkih hromozoma u početnoj generaciji sekvencijalno se smanjuju rekombinacijom i vremenom parovi marker mesta na hromozomu se uravnoteže u učestalosti u populaciji

43. neravnoteža vezanosti (LD) u populacijama je “oblikovana”
mutacijom,selekcijom, protokom gena i genetičkim driftom
LD izmedju 2 lokusa može nastati
mešanjem dve, genetički različite populacije
usled smanjenja veličine populacije (drift), kada varijansa D može biti velika. Brz rast populacije ima efekta na smanjenje LD usled smanjenja drifta
visoki nivoi inbridinga održavaju LD
selekcija na lokusu na koji deluje uzrokuje LD sa neutralnim, blisko vezanim alelima

44. mutacija i LD
kada su oboljenja u populaciji nastala mutacijom kod zajedničkog pretka, vezani aleli se zajednički nasledjuju
LD metod koristi mejoze koje su se desile od nastanka mutacije i koristi se za fino mapiranje gena (male populacije, veće rodoslove)
LD metod je najefikasniji u malim, genetički homogenim populacijama, gde je veća verovatnoća nalaženja pojedinačne, osnivačke mutacije

45. LD oko predačke mutacije

46. pogodan pristup mapiranja lokusa za složene osobine je putem neravnoteže izmedju markera i lokusa
novonastale mutacije su niske učestalosti i u potpunom LD sa alelima ostalih okolnih lokusa na tom hromozomu, sve dok ih rekombinacija ne razdvoji
Vremenom, rekombinacija narušava ovu neravnotežu i učestalosti se izjednačavaju - erozija vezanosti.
Trajanje zavisi od rastojanja (1Mb ~ 70 generacija ~2000 godina)

47. Diastrofična displazija (DTD), jedno od prvih oboljenja za koje je studijama asocijacije i LD mapiran region na hromozomu 5.
populacija Finske, studije asocijacije su pokazale da se radi o nekoliko polimorfnih mesta, a da su 2 vezana za lokus CSF1R.
u grupi obolelih, 95% je imalo haplotip 11, a u kontrolnoj 3%.
populacija Finske je imala samo oko 100 generacija istorije što je procenilo udaljenost gena za DTD (glavnog za poremećaj hrskavice), oko 60kb od CSF1R lokusa

48. Cistična fibroza (CF)
70% su mutacije u ∆F508 alelu
nastale pre više od godina
Verovatne hipoteze:
nastala kao efekat osnivača
održava se prednošću heterozigota
istorija CFTR mutacija se može odrediti preko minisatelitskih markera koji su u LD sa mutacijom

49. 54 haplotipa (br. ponovaka na 3 lokusa), samo 3 česta, ostali sa učestalošću < 1%
haplotip je predački, ravnomerno distribuiran u Evropi, nema ga u drugim delovima sveta
procena da je nastao pre 2627 generacija
(sr.br. mutacija nastalih na∆F508 = 0.867, stopa mutacija 3.3x10-4/lokusu/gametu).
2 haplotipa ( i ) su češći u Centralnoj Evropi i Skandinaviji
Korelacija geografske distribucije alela i ekspanzije neolitske civilizacije,
farmera iz srednjeg istoka...

50. Populaciona genomika otisci selekcije na genomu
Selekciona prednost određenog genotipa i/ili haplotipa (gameta) može biti razlog značajnog odstupanja od gametske ravnoteže u populaciji
Efekat zavisi od pravca, intenziteta, trajanja selekcije
pozitivna selekcija, genetičko prevoženje, balansna, negativna, selektivni otklon itd..različite obrasce varijabilnosti ostavljaju u genomu

51. genetičko prevoženje, (genetic hitchhiking)
ako postoji statistički značajna asocijacija alela na neutralnom lokusu sa lokusom koji je pod selekcijom, taj neutralni alel može deliti sudbinu alela drugog lokusa za koji je vezan haplotipski, a na koji selekcija intenzivno deluje
Ovo se posebno dešava ukoliko je takva asocijacija alela odigrava duže vremena veoma bliskom vezanošću, ili izmedju nukleotidnih mesta unutar lokusa, ili visokom stopom inbridinga.

52. Selektivno brisanje (selective sweep)
proces kojim selektivno favorizovani aleli rastu u učestalosti i time menjaju učestalost i varijanti sa kojima su u neravnoteži vezanosti, smanjujući varijabilnost bliskih regiona na hromozomima
ostavlja zapis u genomu kao pad heterozigotnosti oko selektovane varijante (otklon)
omogućava da se utvrde mesta koja su nedavno prošla selekciju

53. Genetički drift, efektivna veličina populacije (Ne) i LD
Neslučajne asocijacije između entiteta genetičkog polimorfizma mogu nastati kao rezultat stohastičkih procesa vezanih za fluktuacije u brojnosti populacije.
iako je u nekom trenutku veličina populacije znatna, mala osnivačka populacija ili usko grlo u prethodnoj generaciji mogu biti uzrok značajne neravnoteže vezanosti.
Generalno, drift je jači faktor u menjanju učestalosti gameta, na nivou više lokusa, nego da pojedinačnom lokusu
LD između parova SNP zavisi od Ne i od rekombinacione stope između njih. Rastojanja od kb su isuviše mala da bi se rekombinaciona stopa računala preko linkage analiza i rodoslova
Preko LD je moguće proceniti skorašnju Ne populacije, dok se preko heterozigotnosti (H) DNK sekvence procenjuje prosečna Ne kroz duži period

54. Za efektivnu velićinu populacije Ne, i stopu rekombinacije c izmedju lokusa, očekivana vrednost LD preko r2 je aproksimativno
E (r2) ≈1/(1+4Nec)
odakle sledi da kada je Nec veliko, E (r2) teži nuli, a obrnuto, dostiže 1.
LD se zadržava duže u malim populacijama, sa niskom stopom rekombinacije

55. Ne humanih populacija se menja tokom vremena
smatra se, na osnovu LD procene, da je Ne humane populacije bila manja nego što se mislilo, i da je prošla usko grlo pre oko godina posle čega je nastupila ekspanzija.
Mikrosateliti imaju višu stopu mutacija i oslikavaju još skoriju populacionu istoriju.
smatra se da je Ne ~1000 osnivačka populacija savremenih ljudi

56. Linkage disequilibrium and population demography
Mapping disease genes by association requires the identification of linkage disequilibrium (LD) between a marker and a disease phenotype. Several studies of African populations have indicated that levels and patterns of LD in these populations differ from those in non-African populations owing to the age of African populations, admixture with other African and non-African populations, and historical differences in population size and substructure. A disease mutation (shown in violet) that occurs on a single haplotype background will initially be in complete LD with flanking markers on that chromosome (see panel a). In each generation, LD between a marker and a disease allele decays owing to recombination between the sites, and also because of the effects of mutation and gene conversion at marker loci. Young populations, and those that have undergone recent bottlenecks (as probably occurred during the migration of ancestral humans out of Africa), will have haplotype blocks of large to moderate size (panel b, shown in green). In older and larger African populations, in which there has been more recombination, the size of haplotype blocks will probably be smaller (panel c). LD can also be established by a founder event, with the strength and extent of the LD depending on the severity and length of the bottleneck event. Population substructure increases LD owing to a smaller effective population size and to higher levels of genetic drift in subdivided populations. So, if a pooled sample derived from several African populations was analysed, spurious LD would be detected, even if the haplotypes in each subpopulation were in LD. This could lead to erroneous conclusions about the association between genetic markers and disease phenotype. Small populations of stable size are expected to show LD between closely linked loci as a result of increased genetic drift, and larger populations will have fewer sites in LD. New mutations are less likely to be in LD in growing populations owing to the smaller effect of genetic drift, but allelic associations that exist before population expansion might persist for a longer period of time in an expanding population than in a population of constant size.
Tishkoff, Nat Reviews Genet 2002 (www)

57. 34 X-mikrosat. lokusa, urbane i izolovane ruralne, ostrvske subpopulacije Škotske
Nema značajne diferencijacije medju ovim subpopulacijama prema učestalosti alela ali je velika razlika u LD
half-distance LD...na polovini izmedju maksimalne i minimalne vrednosti

58. D = mxmy (p1.x – p1.y)(q1.x – q1.y)
Protok gena i LD
LD izmedju 2 lokusa može nastati mešanjem dve, po genetičkoj strukturi različite populacije
Ako se posmatra delovanje protoka gena na više lokusa…
mešanje populacija sa različitim učestalostima entiteta genetičkog polimorfizma, pa time i različitim gametskim učestalostima može dovesti do neslučajnih asocijacija i neravnoteže vezanosti.
opšta veličina neravnoteže D u dvolokusno dvolalelnom modelu, pri mešanju dve populacije (x i y) u proporcijama mx i my data je izrazom:
D = mxmy (p1.x – p1.y)(q1.x – q1.y)
što je veća razlika u učestalosti alela između 2 populacije, a veliki uticaj predačkih na svaku ponaosob, to je veći D.

59. LD primenjeno na istraživanju kod Lemba, južnoafrička populacija koja govori Bantu jezik, ali tvrdi da potiče od jevrejskih predaka
68% Y- hromozoma Lemba ima semitsko poreklo, ali mt DNK analiza ne potvrdjuje ovakav protok gena po ženskoj liniji
Utvrditi mogući uticaj mešavine populacija na LD kod Lemba
Analizirano u parovima 66 mikrosatelitskih lokusa duž X hromozoma kod:
Lemba
Bantu
Aškenazi

60. visok LD i medju udaljenijim lokusima
13,8% lokusa generalno ima značajan LD
lokusi u LD samo kada su blisko vezani
Visok LD kod Lemba ide u prilog tome
da oni potiču od ne tako davne mešavine
Bantu/Semiti

61. Upotrebom više molekularnih markera sa različitim učestalostima u evropskim i afričkim grupama, moguće je predvideti opseg neravnoteže vezanosti u afroameričkim grupama. na primer:
učestalosti alela Null*1 lokusa FY razlikuju se u uzorcima afričke i evropske populacije za 99,9%, dok se alel 1 lokusa AT3, u istim uzorcima razlikuja za 58%. Na osnovu toga, mx je procenjena proporcija afro - predačkih alela u afro - američkoj mešavini nekog područja, i dobija se početni očekivani D = 0,06.
utvrđeno je da je između ovih markera sadašnji D = 0,02 u istom području, što se slaže sa stvaranjem početnog D, mešavinom, sa razdaljinom lokusa c = 0,22, na hromozomu 1

62. Populacije nastale nedavnom mešavinom su korisne za mapiranje alela koji doprinosi riziku za nastanak oboljenja
Učestalosti markera moraju da se razlikuju medju predačkim populacijama
Studije mapiranja koje koriste mešane populacije su najkompletnije do sada za afroamerikanske i latino populacije i donele su rezultate za samo neke tipove na primer. kancera
rizične varijante za kancer prostate na 8q24 kod afroamerikanaca

63. u studijama asocijacija spajanje populacija u uzorkovanju može dovesti do pogrešnih zaključaka o uzročnosti lokusa:
stvaranje LD usled „mešanja“ dovodi do pogrešnih podataka o asocijacijama genomskih markera i fenotipa
populacije mogu imati suptornosmerni LD usled prethodnog drifta, pa će se „mešanjem“ izgubiti asocijacije!

64. identifikovati LD i distribuciju haplotipova u genomu
osnovan 2002
cilj: opisati zajednički obrazac variranja humanih DNK sekvenci, ili, napraviti haplotipsku mapu genoma čoveka
identifikovati LD i distribuciju haplotipova u genomu
ovo je od značaja za:
identifikaciju lokusa za složene osobine, kod čoveka, npr. dijabetes, kancer, moždani udar, koronarna oboljenja, depresija, astma
razumevanje populacione istorije ljudi koja se oslikava u različitosti i sličnosti
za dizajn i analizu studija genetičkih asocijacija koje zavise od informacije o LD kroz genom – bitno je znati koliki su i gde su predački segmenti hromozoma da bi se koristili odgovarajući SNP markeri 64

65. populacije različitog porekla (evropska, afrička, azijska); obrazac varuranja nadjen za 3,1 milion SNPs, a zatim subset od 1,6 milion SNPs kod još 7 populacija
Cilj:identifikovati zajedničke i populaciono specifične haplotipove
prva analiza osoba i to:
90 Yoruba osobe (30 trijada roditelji-dete) iz Ibadana, Nigerija
90 osoba (30 trijada) evropskog porekla iz Jute, USA
45 Han osoba iz Pekinga
44 Japanaca iz Tokija
HapMap uzorci 65

66. Haplotipski blok je region za koji nema podataka o rekombinaciji
region u kome <0,05 poredjenja medju SNPs daje rekombinaciju
blokovi obuhvataju 67-87% genoma, a 13-33% analiziranih regiona pokazuju puno veću raznovrsnost i rasutost i razlike medju jedinkama
Granice hap blokova su na sličnim pozicijama kroz genom
Hap blokovi variraju po veličini ali tipično je da su 5-15kb, osim u afričkom uzorku (7,3%) usled većeg broja generacija od osnivačkog, predačkog genoma
četiri do šest haplotipa po bloku dovoljno da opiše sve hromozome.

67. značajno za studije složenih oboljenja preko LD; za svaki blok, nekoliko SNPs (tagovanih-SNPs) se može odrediti da pokažu koji blok hromozom nosi ne mora se raditi genotipizacija SNPs po bloku
KonstrukcijaHapMap ide u 3 koraka. (a) SNPs se identifikuju u DNK više osoba. (b) susedni SNPs koji se zajedno nasledjuju se kompiliraju u "haplotipove." (c)"Tag" SNPs unutar haplotipova se identifikuju kao unikatni , karakteristični, za te haplotipove.
Primer: genotipizacijom 3 SNPs na slici, može se identifikovati koji od 4 haplotipa je prisutan kod svake osobe

68. “triangle plot” : MET gen se sastoji iz 2 haplotipska bloka, jedan od 17 kb a drugi od 110 kb, sa parovima SNPs sa vrednošću D iznad specifičnog prag –date su ispod svakog para SNP, npr rs437 je SNP 1 a rs je SNP 2, i oni imaju vrednost 93 za D

69. LD je opšti fenomen genoma čoveka
LD je opšti fenomen genoma čoveka. Dat je deo genoma u kome su hap blokovi sa D = 1 odvojeni regionima u kojima se odigrala rekombinacija. Najveći blok ima 80 kb.

70. LD varira medju populacijama i koristi se za fino mapiranje
Kancer dojke i FGFR2 na populacijama Azije, Evrope, afroamerikanskoj dalo podatke o regionu koji doprinosi riziku u evropskoj
Više lokusa koji doprinosi riziku sadrže nezavisno nastale varijante od kojih su neke poulaciono specifične
istorija populacije je bitna: što je starija populacija, i što je duže zadržala veličinu manje je predačkih segmenata
LD se obično javlja u izolovanim, ili skoro osnovanim manjim populacijama, ili nastaje mešavinom populacija

71. Pozitivne asocijacije usled LD mogu dati naizgled kontradiktorne rezultate:
pošto LD zavisi od populacione istorije, osobina može dati pozitivnu asocijaciju sa alelom A1 u jednoj izolovanoj populaciji, sa alelom A2 u drugoj, a ni sa jednim u velikoj, mešanoj.

72. Multietničko mapiranje
upotrebom HapMap podataka (faze 2 i 3) i dogovarajućih statistika
odabir SNPs informativnih po poreklu ili većeg broja slučajno uzetih SNPs pomažu da se izbegne efekat stratifikacije
“alelske učestalosti variraju medju populacijama”, ali više varijanti će biti često u multietničkoj populaciji nego u bilo kojoj posebno koja je čini
Isto važi i za efekte na ispoljavanje oboljenja; u multietničkoj populaciji će biti jači signal nego u pojedinačnoj etničkoj grupi
detekcija asocijacije zavisi od ukupne učestalosti, veličine uzorka i efekta, ali doprinos npr. retkih alela u malim grupama nije kumulativan u mešovitoj!
GWAS sa multiplim populacijama nude velike mogućnosti, ali označavanje, karakterističnim markerima (”tagovanje”) je bitno pa genetička heterogenost može ostati problem...
ako je tačna hipoteza “retke varijante/učestalo oboljenje”, spektar uzrokujućih varijanti će biti različit medju populacijama

73. HapMap faza 2 pruža panel referentnih (0,5-1 milion) SNPs za populacije single-continental porekla (Eu, Azija, Afrika)
HapMap faza 3 uključuje genotipove za više populacija, Latino, Afroamero, ali je broj čestih SNPs manji nego u 2.
NGS i 1000 Genome Project
Disease researchers will combine the 1000 Genomes data with the genotype data in their disease GWA study to impute the genotypes in their samples for millions of additional variants beyond those they genotyped directly. They will do this computationally, with no genotyping cost. The additional genotype data will allow the researchers to localize the disease-associated regions more precisely.
Once the disease-associated regions are identified, researchers will want to know all of the variants in those regions. The Project will provide data on almost all of the variants with a frequency of at least 1% in the populations studied. This will save disease researchers the time and expense of having to sequence their own samples. Although this list will not tell them which variants cause the increased risk for the disease, it will give them the set of suspects. They will then do experimental studies to determine which genes, genetic elements, and variants functionally cause the increased risk of disease.
Many researchers will compare the allele frequencies and LD patterns that they find in their studies with those in the 1000 Genomes data. Researchers will also examine the 1000 Genomes data to study recombination, natural selection, and population structure and admixture.

74. zašto su česta oboljenja - česta?
mogu li GWAS otkriti potpuno genetičku podložnost kod složenih osobina?
Komplikacije stvaraju CNV (varijacije broja kopija) u genomu zdravih osoba, kojiih ima puno, i pitanje je koliko SNPs studije mogu otkriti njihovu vezu sa oboljenima
zašto su česta oboljenja - česta?
Dve hipoteze, uzajamno se dopunjuju:
učestalo oboljenje-učestala varijanta
mutaciono selekciona hipoteza

75. često oboljenje - učestala varijanta (CDCV)
....kontradiktorno
Asocijacije nadjene sa GWAS su ponovljive studije – to ukazuje da su neki predisponirajući faktori zaista predačke, učestale varijante
Ali njihov umereni efekat ostavlja pitanje koliko podložnosti one objašnjavaju
Kancer dojke..dvostruko učestaliji kod rodjaka prvog stepena obolele žene nego u opštoj populaciji, a GWAS su doprinele samo sa 3,65 ranijim studijama koje su otkrile lokuse koji doprinose 25% ruziku
Teško je po ovoj hipotezi objasniti da su učestale varijante opstale hiljadama godina uz predačke haplotipske blokove u visokoj učestalosti pored prirodne selekcije.Moguće je ipak kada se radi o oboljenjima koja nastaju kasno u životu

76. Mutaciono - selekciona hipoteza
oboljenja su česta usled mutaciono-selekcionog balansa
Varijante sa jakim efektom biće uklonjene iz populacije prebrzo da bi ostale u predačkim haplotipskim blokovima. Nastaće de novo mutacije stvarajući nove umereno štetne varijante
najveći deo predispozicije za složene osobine
može postojati heterogenost na nivou lokusa (različite osobe-mutacije u različitim genima istog puta) i alela (mutacije mogu biti kod različitih osoba u različitim delovima istog gena)
Iako pojedinačna mutacija može biti retka,što otežava analize, ceo metabolički put može često izostati
Najbolje rezultate daju studije sa sekvenciranim kandidat genima u velikom uzorku slučajeva i kontrola