1. Genetika multifaktorijalnih bolesti
dr Jelena Karanović, istraživač saradnik
Centar za humanu molekularnu genetiku
Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu
Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017

2. Faktor 1 Faktor 4 Faktor 3 Faktor 2 Faktor N
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017

3. Multifaktorijalne bolesti (MF bolesti)
Primeri bolesti: kardiovaskularne bolesti, različite vrste karcinoma, psihijatrijske bolesti...
Faktori rizika ili protekcije: epigenetički, genetički, sredinski (sinergizam)
Efekti faktora: direktni (glavni, nezavisni, individualni) i indirektni (interaktivni)
Epigenetika
Genetika
MF fenotip
Sredina
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 3

4. Retke bolesti vs. Multifaktorijalne bolesti
Genetički faktori
Retke bolesti vs. Multifaktorijalne bolesti
Retka promena u sekvenci DNK
(Mutacija)
Retka bolest
Retke ili česte promene u sekvenci DNK
(Genetičke varijante)
Multifaktorijalna bolest

5. Genetički faktori Genetičke varijante (polimorfizmi sekvence DNK)
Razlike u sekvenci DNK između dve osobe u populaciji
Učestalost veća od 1% (ali ima i retkih varijanti, <1%)
Aleli
Različite varijante nekog gena ili sekvence DNK
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 5

6. Genetičke varijante (polimorfizmi sekvence DNK)
Tipovi:
Varijante (polimorfizmi) nukleotidne sekvence
Varijante (polimorfizmi) broja kopija
Varijante (polimorfizmi) dužina sekvence
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 6

7. Varijante (polimorfizmi) nukleotidne sekvence
Tačkaste varijante (single nucleotide variants - SNVs ili single nucleotide polimorphisms - SNPs):
čine 90% svih genetičkih varijanti – oko 10 miliona SNVs u genomu čoveka
Česte (učestalije od 1%): mala penetrabilnost
Retke (učestalost manja od 1%): velika penetrabilnost
Sinonimne (neutralne-osim ukoliko se ne nalaze u mestu za splajsovanje)
Nesinonimne (uglavnom funkcionalne)
Inserciono-delecione varijante:
Indel varijante: insercije/delecije 1-50 nukleotida
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 7

8. Varijante (polimorfizmi) broja kopija
Varijacije u broju kopija (Copy-number variations -CNVs):
Razlike u broju kopija gena ili neke druge sekvence DNK od 0.5kb do nekoliko megabaza u odnosu na referentni genom
Delecije/duplikacije/kompleksne
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 8

9. Varijante (polimorfizmi) dužine sekvence
Razlike u broju tandemski ponovljenih sekvenci – 5-50x
Mikrosateliti – short tandem repeat polymorphisms (STRs): ponovak dužine 1-5bp
Minisateliti – variable number tandem repeats (VNTRs): ponovak dužine ≥6bp
Molekularni markeri u linkage studijama
Utvrđivanje DNK profila u forenzičkoj genetici
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 9

10. Genetički faktori Velika genetička varijabilnost
Dve osobe (osim jednojajčanih blizanaca) imaju oko 99% identičnu sekvencu DNK
0.5% razlika potiče od SNVs...približno 1 nukleotid na 1000=SNV
0.4% razlika potiče od CNVs
0.1% razlika potiče od ostalih retkih varijanti
Individualne razlike su veće nego među populacijama
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 10

11. Pristupi u izučavanju MF bolesti
Familijarne – linkage studije
Pomoću molekularnih markera utvrđuje se da li član porodice nosi rizik za MF bolest
Testiranje retkih varijanti
Populacione – studije genetičke asocijacije
Procena uticaja genetičkih faktora na razvoj MF bolesti u populaciji
Testiranje čestih varijanti (uglavnom)
Statističke asocijacije usmeravaju dalje testiranje identifikovanih varijanti u funkcionalnim studijama
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 11

12. Studije genetičke asocijacije – pristupi
Geni kandidati
Na “maloj” skali (pojedinačne, desetine, stotine, hiljade genetičkih varijanti)
Hipoteza na osnovu biološke funkcije produkata gena
GWAS (genome-wide association studies)
Na velikoj skali (stotine, hiljade, milioni genetičkih varijanti)
Nema početne hipoteze
GWIS (genome-wide interaction studies)
GWAS katalog:
Last data release on
3233 publications/studies
55707 unique SNP-trait associations
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 12

13. Studije genetičke asocijacije – pristupi
Hipoteza “česta bolest-česta varijanta”
Česte genetičke varijante daju samo mali doprinos razvoju MF bolesti
Jedna genetička varijanta nije niti neophodan niti dovoljan uslov za razvoj MF bolesti
Kumulativan efekat
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 13

14. Studije genetičke asocijacije – pristupi
Česte tačkaste genetičke varijante
Iz literature ili prema biološkoj funkciji - poznatoj ili predviđenoj
Direktna asocijacija sa fenotipom
Tag varijante (tagSNPs, tagSNVs)
Testiranje jedne varijante daje informaciju o ostalim varijantama u okviru istog haplobloka
U osnovi je fenomen Linkage disequilibrium-a (LD): neslučajna asocijacija alela na dva ili više lokusa na istom hromozomu
Indirektna asocijacija sa fenotipom
Značajno se redukuje broj testiranih varijanti
10 miliona varijanti pokriveno sa 300, ,000 tag varijanti
Linkage disequilibrium (LD)
Termin iz populacione genetike
Neslučajna asocijacija alela na dva ili više lokusa na istom hromozomu
Značajno češća ili ređa kombinacija alela (genetičkih markera) u populaciji u odnosu na nasumično (očekivano) formiranje haplotipova zasnovano njihovoj na frekvenciji
U osnovi je fenomen DNK rekombinacije
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 14

15. Genetičke baze podataka
(više nije u funkciji)
exac.broadinstitute.org (Exome Aggregation Consortium – ExAC)
(Genome Aggregation Database )
Katalog humanih genetičkih varijanti (uglavnom čestih tačkastih, ali sve više ima i retkih i CNVs)
Sadrže informacije o varijantama: gde se nalaze, kog su tipa i koliko su učestale u različitim populacijama
Ne sadrže fenotipske podatke (zaštita poverljivih podataka o pacijentima)
Na osnovu njih istraživači mogu da otkriju koje su varijante povezane sa određenim bolestima
Veliki doprinos za prevenciju, dijagnostiku i lečenje bolesti
ExAC trenutno preko egzoma sekvencirano, uskoro egzoma, plus kompletnih genoma (podaci iz godine)
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 15

16. Studije genetičke asocijacije
Dizajn
De novo
Replikativne
Meta analize: veća statistička moć
Longitudinalne: praćenje progresije/regresije bolesti i farmakogenetika
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 16

17. Studije genetičke asocijacije – vrste studija
Populacione studije (unrelated) ukoliko je potvrđena heritabilnost
slučajevi i kontrole (case-control):
kontrole su iz opšte populacije (nepoznat status MF fenotipa) ili
supernormalne kontrole (zdrave u pogledu kliničkog entiteta koji se ispituje)
samo slučajevi (case-only)
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 17

18. Studije genetičke asocijacije – redosled
Sakupljanje uzorka
Demografski podaci (pol, starost, etnička pripadnost...) i razni podaci od interesa
Uniformnost uzorka
Veličina uzorka
Genotipizacija
PCR, RFLP, Sangerovo sekvenciranje, čipovi, NGS...
Kontrola kvaliteta
Statistička analiza
Testiranje Hardy-Weinberg-ove ravnoteže
Testiranje asocijacije alela/genotipova/haplotipova, analiza varijanse...
Regresioni modeli (linearni/logistički)
Različiti on-line ili komercijalni statistički programi (user-friendly ili programiranje)
Parametri: verovatnoća (p), odnos verovatnoća (odds ratio, OR), relativni rizik
Frekvencije alela i genotipova ostaju transgeneracijski konstantne u velikoj opštoj populaciji u kojoj je ukrštanje slučajno i nema mutacija, migracija, selekcije i genetičkog drifta.
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 18

19. Studije genetičke asocijacije – komplikacije
Dodatno usložnjavanje MF fenotipa
Plejotropija (jedan gen – više različitih fenotipova)-nespecifičan MF marker
Preklapanje simptoma (više fenotipova sa istim/sličnim simptomima)
Geni modifikatori
Redukcija složenosti
Intermedijarni fenotipovi (endofenotipovi) MF
fenotip 1 MF
fenotip 2
MF fenotip 1 MF
fenotip 3 MF
fenotip 4
Gen
MF fenotip 2 MF
fenotip n
MF fenotip n
Ispituje se set/podskup gena koji definišu samo deo finalnog fenotipa (endofenotip) radi pojednostavljivanja.
Set gena 1
Endofenotip 1
Genetika = n gena
Set gena 2
Endofenotip 2
MF fenotip
Set gena n
Endofenotip n
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 19

20. Studije genetičke asocijacije – ograničenja
Statistička ograničenja
Greška tipa I
Detekcija nepostojećih efekata
najčešće α=0.05 (za jedan SNV)
Greška tipa II
Nema detekcije pravih efekata
najčešće β=0.2
Moć studije P=1-β (optimalno ≥80%)
Smanjenje grešaka: povećanje veličine uzorka, bolja kontrola fenotipizacije, gušća genotipizacija.
Izazov danas: adekvatna FENOTIPIZACIJA i statističke ANALIZE velike količine podataka
Zlatni standard: GENOTIPIZACIJA
We define the power of an association test to be the probability that the association test rejects the null hypothesis under the condition that the polymorphism is truly associated with the phenotype.
FIGURE 1. Distribution of the test statistic under both null (left) and alternative (right) hypotheses. The vertical line is the critical value of the test. The black and gray areas under the alternative hypothesis represent the power of the test. The shaded gray area refers to the type I error rate of the test. The unshaded area under the alternative hypothesis is the probability of committing a type II error.
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 20

21. Studije genetičke asocijacije – nekonzistentnost u rezultatima
Pozitivna/negativna asocijacija? Rizik/protekcija?
Uzrok:
Nedovoljne veličine uzorka tj. moći nekih studija
Razlika u demografskim podacima (pol, starost, socioekonomski status)
Postojanje diferencijalne ili dodatne dijagnoze
Uticaj lekova
Etničke razlike
Metodološka ograničenja (objektivna i subjektivna)...
Rešenja:
Uticaj mogućih kovarijata (covariates) treba kontrolosati tokom statističke obrade podataka (adjustments)
Adekvatno tretirati moguće konfaundere (confounders)
Bonferroni korekcija ili permutacije za multipla testiranja
Kontrola stratifikacije u uzorku
Neophodnost replikativnih studija koje imaju veliku statističku moć
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 21

22. Kompleksnost MF fenotipa
Heritabilnost (h2) = udeo genetičke varijanse u ukupnoj varijansi fenotipa.
Određena familijarnim studijama, studijama na blizancima i studijama sa usvojenom decom
Studije genetičke asocijacije – napredak u realnijoj proceni h2
“missing h2” = retke genetičke varijante, interakcije između gena/varijanti i/ili između gena i sredine
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 22

23. Interakcije u osnovi MF bolesti – najčešće ispitivane
Između gena (genetičkih varijanti) – epistatičke interakcije
Statističke
Nisu stvarne (biološke)
Koji interakcija alela sa različitih lokusa povećava/snižava rizik za MF
Između gena i sredine – GxE interakcije
Koji genotip(ovi) u interakciji sa sredinom povećavaju/snižavaju rizik za MF
Epigenetika
MF fenotip
Genetika
Sredina
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 23

24. Predispozicija za MF bolest
Individualna osetljivost/podložnost (susceptibility) za MF bolest
Osetljivost/podložnost je nasledna je u porodicama
Osetljive/podložne osobe imaju veći broj visoko-rizičnih alela (prag osetljivosti je fiksiran, a kriva MF fenotipa pomerena udesno)
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 24

25. Interpretacija rezultata studija asocijacije
Cilj studija genetičkih asocijacija je razvoj genetičkih testova za otkrivanje predispozicije za MF bolesti (na osnovu individualanog DNK profila)
Farmakogenomika: utvrđivanje optimalnog/individualnog odgovora na terapiju
Neophodnost replikativnih konzistentnih nalaza - stabilni specifični markeri MF fenotipa
Statisička asociranost ≠ uzročnost
Oprez prilikom tumačenja, posebno u odnosu sa pacijentima
U vidu procenta ili verovatnoće rizika?
Naglašavanje složene etiologije MF bolesti
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 25

26. U našim rukama – kontrola okidača MF bolesti
Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017