1. KLINIČKI ZNAČAJ KVANTITATIVNOG ODREĐIVANJA SLOBODNIH LAKIH LANACA IMUNOGLOBULINA Danica Matišić

2. MONOKLONSKE GAMAPATIJE
Monoklonske gamapatije: mogu biti benigne ili maligne-multipli mijelom
Klinički simptomi: od asimtomatskog neprogresivnog stadija do malignog agresivnog multiplog mijeloma
Laboratorijska dijagnostika:
1. korak:
elf.prot. u serumu
ukup.prot.IgGAM,IF, β2m, kreatinin i Ca u serumu,te BJP u serumu i urinu, SE,KKS, punkcija sternalne ili bedrene kosti
Monoklonski
imunoglobulin
Plazma stanica
Antitijelo
B limfocit

3. Vizualni pregled
Bez promjena
Bence Jones protein?
Klinička sumnja ili
prisutnost monoklonske vrpce
Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza
Elektroforeza proteina u mokraći
(100 x ukonc. uzorak)
Definicija M-P
(određ. razreda i tipa)
Negativ. nalaz
Prisutan BJ protein
Denzitometrijska kvantifikacija M-P
Opisni nalaz + klinička informacija daju
tumačenje nalaza
Elektroforeza serumskih proteina
KROHEM SKUPINA Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković
Ako na elektroforetskoj slici, najmanje 100x ugušćenog urina, ne nalazimo suspektnu monoklonsku vrpcu nalaz BJP smatramo negativnim
DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA
DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA

4. Dr. Henry Bence Jones
Engleski liječnik i kemičar: rođen ; umro
petak, dr. MacIntyre i dr Watson
Dragi dr. Bence Jones!
Epruveta sadrži urin vrlo visoke specifične težine. Kod kuhanja nastaje jako zamućenje. Nakon dodatka dušične kiseline, uzorak se zapjeni, oboji crvenkasto i zatim postane bistar; ali hlađenjem poprima konzistenciju i izgled koji se uočava. Toplina ih oslobađa.Što je to?
dr. Bence Jones: The Lancet, (Dr. MacIntyer: 1850.)
eponim Bence-Jones protein koristi se tek nakon njegove smrti
1922.identificirani tip I i II BJP antiserumom imuniziranih kunića
1956.Ouchterlony tehnikom pokazano da se BJP ponašaju isto kao i mijelom-protein i označeni su kao  i 
2001.imunotest (poliklonska At): mjerenje slobodnih lakih lanaca u serumu

5. Space is the laboratory of the next millennium
Kristali Bence-Jones proteina Razumijevanje strukture kristala BJP moglo bi biti ključno za razvoj selektivne terapije lijekovima.
Microgravity
Space is the laboratory of the next millennium
Mikrogravitacijski uvjeti u svemiru su jedinstveni okoliš za istraživanja koja vode novim produktima i tehnologijama.
STS-95
STS-80

6. Kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca - SLL
Razvoj reagensa za kvantitativno određivanje SLL, kapa (κ) ili lambda (λ) tipa, povećao je njihovu kliničku važnost
Refer. interv.: SLL κ
Refer. interv.: SLL λ
Refer. interv. κ/λ
SERUM
3,30 – 19,40
5,71 – 26,3
0,26 – 1,65
URIN
1,35 – 24,19
0,24 – 6,66
2,04 – 10,37

7. KROHEM SKUPINA Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković
Elektroforeza serumskih proteina
Vizualni pregled
Klinička sumnja ili
prisutnost monoklonske vrpce
Bez promjena
Bence Jones protein?
Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza
FREELITE™ :
SLLκ, SLLλ + κ/λ
Definicija M-P
(određ. razreda i tipa)
Denzitometrijska kvantifikacija M-P
Elektroforeza proteina u mokraći
(100 x ukonc. uzorak)
Ako na elektroforetskoj slici, najmanje 100x ugušćenog urina, ne nalazimo suspektnu monoklonsku vrpcu nalaz BJP smatramo negativnim
Negativ. nalaz
Prisutan BJ protein
Opisni nalaz + klinička informacija daju
tumačenje nalaza
Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza
DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA
DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA

8. Kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca
serumska konc.SLL korelira samo s aktivnošću koštane srži, što znači da njihov nalaz može biti neovisan biljeg monoklonskih gamapatija
jedan posebno važan aspekt SLL je njihov kratak poluživot:
2-3 sata za kapu i 5–6 sati za lambdu;
što je 150 x kraće vrijeme od 21 dana koliko je poluživot IgG molekule
tako konc. slobodnih lakih lanaca omogućuje vrlo brzo procjenu učinka
kemoterapije: dana brže nego konc. M Ig
bolesnici koji su prema nalazu intaktnog M Ig, u remisiji mogu
još uvijek imati povišenu konc. SLL što indicira ostatnu bolest
koristeći isti argument, bolesnici čija konc SLL počinje rasti nakon
modernog intenzivnog tretmana ide u prilog relapsu bolesti

9. Kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca - DOSADAŠNJA ISKUSTVA tak godina upotrebe testa za kvantitativno određivanje BJP promijenilo je pristup dokazivanju i praćenju monoklonskih gamapatija FLC test je ugrađen u: dijagnozu-skrining panel prognozu-testiranje i praćenje bolesti Učinak u kliničkoj praksi je bio značajan upravo zbog -povećane osjetljiv. za praćenje bolesti uzrokovanih prolifer. PS -boljeg razlikovanja agresivnih od benignih premalignih bolesti (MGUS) -bolja procjena hematoloških odgovora u monokl. bolest.lakih lanaca kao i pojadnostavljenje testiranja bolesnika Pojava testa je isto tako izmjenila pristup u laboratorijskom testiranju bolesnika

10. J. A. Katzman - Mayo Clinic
KROHEM SKUPINA Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković
J. A. Katzman - Mayo Clinic
DIJAGNOZA:
– FLC test uklanja potrebu ukoncen satnog urina kao i uopće obradu urina. Tako se preporučeni POSTUPNIK za def. “M” proteina treba sastojati od:
1. elektrof. prot. u serumu
2. IF seruma
3. FLC testa u serumu te
4. FLC test u urinu samo kod
sumnje na AL amiloidozu
Urin će se obrađivati diskontinuirano tj. kod raznih disproteinemija kao i za praćenje bolesti jednom kad je već monoklonski protein identificiran
Elektroforeza proteina u mokraći (100xkonc urin)
Negativ. nalaz
Prisutan BJP
Imunofiksacija
DIJAGNOSTIČKI POSTUPNIK ZA DEFINIRANJE MONOKLONSKOG PROTEINA
Vizualni regled
Bez romjena
Bence Jones P ?
Klinička sumnja ili
prisutnost monoklonske vrpce
Imunofiksacija
Defi(određ. razreda i tipa)
nicija M-P
Denzitometrij. kvanti. M-P
Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza
Elektroforeza serumskih proteina
FREELITE™ :
SLLκ, SLLλ + κ/λ

11. FLC test je ugrađen u: DIJAGNOZU-skrining panel nadalje su razmatrane opcije i uklanjanja IF iz POSTUPNIKA. Skrining panel sa elektrof. prot. u serumu i FLC testom (uz selektivni izbor IF seruma i urina) je dostatan za dijagnozu multiplog mijeloma i Waldenström makroglobulinemije s malim padom osjetljivosti (od 1%) u dijagnozi AL amiloidoze uz obaveznu procjenu odnosno odluku kliničara. +
FLC kapa i lambda i
kapa/lambda omjer
Elektroforeza proteina u serumu
FREELITE:
nalaz abnormalan
SPE normalna
FREELITE:
nalaz abnormalan
SPE abnormalna
FREELITE:
nalaz normalan
SPE abnormalna
FREELITE:
nalaz normalan
SPE normalna
Prisutan intaktni monokl. Ig i/ili BJP
Prisutan intaktni monoklonski Ig
Prisutan BJP-MMLL
M-P negativan

12. FLC nalaz abnormalan
SPE normalna

13. FLC nalaz abnormalan
SPE abnormalna

14. FLC nalaz normalan
SPE abnormalna

15. FLC test je ugrađen u: PROGNOZU -testiranje FLC test u serumu je isto tako koristan biljeg za prognozu progresije MGUS u MM MGUS je premaligna bolest sa brzinom progresije u MM od 1%/god. Brzina progresije kod bolesnika s normalnim omjerom FLC ϰ/λ i “M” Ig <15g/L je 0,1%/god. Stoga, ovakve bolesnike ne će trebati podvrgavati kompletnim kliničkim obradama (1x na god) a ujedno će se moći veća briga pružiti rizičnim bolesnicima. Biti će potrebno napraviti promjene i u laboratorijskoj obradi ovakvih bolesnika.

16. FLC test je ugrađen u: PRAĆENJE bolesti
koncentracija “uključenih” FLC ima važnu ulogu u praćenju bolesti. Ta uloga će biti jedino uskraćena kod bolesnika sa nemjerljivim “M” prot. u serumu ili urinu.
Dugotrajno praćenje mjerenja konc. FLC u serumu pokazalo je da
se praćenje bolesti može voditi bez obrade uzorka urina.
(Skupljanje 24 satnog urina je: mukotrpno za bolesnike i uglavnom netočno)

17. B.K.1.

18. B.K.2.

19. IF BJP urin B. K. 3
B. K. 3

20. K. M.
IF BJP urin

21. M.LJ 1.

22. M.LJ. 2

23. Levinson S. Stanley S. Urine immunofixation electrophoresis
remains important and is complementary to serum free light chain.
Clinical Chemistry and laboratory medicine 2011: 49:
...I conclude that urine IFE remains important and is complementary
to serum FLC assay, although the best algorithms for use remains to
be elucidated.
IFE BJP kapa
IFE BJP lambda
IFE BJP poliklonski

24. Kontrola kvalitete laboratorijske evaluacije
M-proteina
ključna komponenta interne laboratorijske kontrole je izravan kontakt biokemičara i kliničara o slučaju koji je neuobičajene prirode ili ako postoji bilo kakav nesklad u nalazu.

25. C. A. Hutchison: Use of High cut-off haemodialysis for treatment of myeloma kidney: worldwide experience to date M. Cook: EuLITE trial: results of date Paraproteinemijske bubrežne bolesti dijelimo na: primarne glomerularne i posljedične tubulo intersticijske bolesti. Odlaganje FLC je direktno odgovorno za patološke procese tubulo intersticijskog oštećenja.
Nakon filtracije FLC se vežu na heteromerične receptore koji se sastoje od kubilina i megalina i time injiciraju reapsorpciju u proksimalne tubule. Poslije endocitoze, FLC budu hidrolizirani i vraćeni kao AK u cirkulaciju.
FLC su otrovni: zbog potencijalnih interakcija sa svim dijelovima nefrona; nefrotoksični potencijal FLC je ovisan o njihovoj fizikalno kemijskoj kompoziciji kao i utjecaju okoliša u kojem se nalaze. Ovi faktori određuju tip i težinu oštećenja bubrega
Laki lanci uzrokuju intracelularni oksidativni stres(NFκB,MCP1)
varijabilna domena lakog lanca daje interakciju s THP te konačni produkt odlaganja tih kompleksa je nastanak netopivih voštanih cilindara

26. Diseases associated with monoclonal FLC: AL Amyloidosis; Chronic lymphocytic leukaemia; Non-hodgkin lymphoma S. Kumar: AL Amyloidosis– role of FLC in risk estimation P.Hawkins: FLCs in the amyloidosis
s FLC
IF 24-satni urin
MM skrining
Preporuka
Nije nužno
AL skrining
Prognoza:
MGUS,AL,MM,
Plazmocitom
AL, LCDD, ili oligosekretorni MM
(AL & LCDD)
MM teških lanaca
MMLL
Rezultati raznih studija su pokazali
da kod primarne AL amiloidoze konc.
FLC korelira sa stupnjem zahvaćenosti
napadnutog organa i određivanje se
provodi:
1. za prognozu bolesti
2. za praćenje bolesti
3. preporuča se uz FLC
određivati i troponin T kao i NT-ProBNP
4. kvantitativno mjerenje FLC u kombinaciji
sa IF seruma i urina je preporučeni protokol
kod sumnje na AL amiloidozu u UK
(imunohistokemijsko bojenje i dalje ostaje)
G. Mead: Diseases associated with polyclonal FLC: Hepatitis C; Autoimune bolesti; Hodgkin limfom; AIDS –limfom;

27. M. Cook: EuLITE trial: results of date
C. A. Hutchison: Use of High cut-off haemodialysis for treatment of myeloma kidney: worldwide experience to date i
M. Cook: EuLITE trial: results of date
Pokusi in vitro i matematički modeli su pokazali da je uklanjanje FLC hemodijalizom
ovisno o veličini pora dijalizacijske membrane: r >5 nm)
Uskoro pojava posebnih membrana za dijalizu tzv. HCO-HD 1100 (high cutt-off
haemodialysis) tvrtke Gambro i Ortho-Biotech
razvijen je i poseban European Trial of Free Light Chain Removal by Extended Haemodialysis u nefropatiji uzrokovanoj cilindrima – tzv. EuLITE
- primarni učinak EuLITE triala omogućuje pauze dijaliziranja od 3 mjeseca
hemofiltracija ovisi: o protoku krvi; permeabilnosti membrane; hidrostatskom tlaku na membrani; površini hemofiltera (albumin, IL-6, FLC, mioglobin, β2m, inulin, vitamin B12 -1,3kD-68kD)

28. C. A. Hutchison: Use of High cut-off haemodialysis for treatment of myeloma kidney: worldwide experience to date -M. Cook: EuLITE trial: results of date
S. Stringer: Polyclonal FLC and chronic kidney disease
30 – 40% oboljelih od MM razvije tzv. mijelomski bubreg
propadanje bubrežne funkcije popraćeno je s proupalnim stanjem i kao jedna od posljedica je i poliklonsko stvaranje lakih lanaca
toksičnost monoklonskih FLC je dobro razjašnjena (npr. stvaranje cilindara s THP) za razliku od poliklonski sintetiziranih lakih lanaca
u tijeku su mnoga ispitivanja koja pokušavaju razjasniti ulogu poliklonski sintetiziranih lakih lanaca u stanjima kroničnih bubrežnih bolesti (KBB)
za sada je poznato da poliklonski sintetizirani FLC, za razliku od monoklonskih, ne aktiviraju epitel proksimalnih tubula ali u distalnim tubulima stvaraju cilindre s THP te tako postaju surogat za progresiju KBB
posljedica: razvijanje nefropatije te stvaranje ovisnosti o dijalizi te sklonost infekcijama koji otežavaju liječenje

29. HVALA NA PAŽNJI