1. Hagnýting EPR litrófsgreininga í RNA rannsóknum
Höfundur fyrirlestrar: Egill Skúlason
19. febrúar 2003
Háskóli Íslands
Raunvísindadeild
Efnafræðiskor
Eðlisefnafræði 5

2. Helstu heimildir
Í fræðilegri útlistun á EPR litrófsgreiningu notast ég bæði við bækur Atkins og Banwell en nýti mér einnig hina margrómuðu og verðlaunuðu heimasíðu Ágústar Kvarans.
Edwards, T.E., Okongi, T.M., Robinson, B.H., Sigurðsson, S.T. (2001). Site-Specific Incorporation of Nitroxide Spin-Labels into Internal Sites of the TAR RNA; Structure-Dependent Dynamics of RNA by EPR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. Vol 123,
Edwards, T.E., Okonogi, T.M., Sigurðsson, S.T. (2002). Investigation of RNA-Protein and RNA-Metal Ion Interactions by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy: The HIV TAR-Tat Motif. Chemistry & Biology, Vol. 9,

3. Innihald fyrirlestrar
Undirstöðuatriði fræðanna á bak við EPR.
Rannsóknir á RNA.
Mikilvægi EPR í RNA rannsóknum.
„Spunamerkingar“ á RNA.
Viðfangsefni og aðferðir rannsóknanna sem greinarnar byggja á.
Niðurstöður rannsóknanna.

4. EPR = ESR
Flestar stöðugar sameindir haldast saman með tengjum þar sem rafeindaspunar eru paraðir. Undir þeim kringumstæðum er enginn „sýnilegur“ spuni, ekkert rafsegulvægi og því ekkert samspil á milli rafeindaspuna og segulsviðs.
Hins vegar eru til atóm og sameindir sem hafa eina eða fleiri rafeindir með óparaðan spuna og það eru þau tilfelli sem sýna rafspunamerki (Electron Spin Resonance eða ESR) í litrófsgreiningu.
Þar sem þessi fyrirbæri eru einnig meðseglandi eða paramagnitísk, þá er þessi tegund litrófsgreiningar oft nefnd Electron Paramagnetic Resonance eða EPR.

5. EPR litrófsgreinir
Algengast er að segulsviðið sé 0.3 T, sem þarf því 9 GHz eða 3 cm örbylgju til að merki fáist.

6. 2S+1 = 2*½ + 1 = 2 eða ms = S, S-1,...,-S = +½ og -½
Fræði EPR
Þegar óparaðar rafeindir eru til staðar í sameindum þá er spunastefna þeirra óregluleg.
Þegar sameindunum er komið fyrir í segulsviði þá stefna þessir „litlu seglar“ (sem rafeindaspuni er í raun og veru) í ákveðnar áttir.
Þar sem spunaskammtatala rafeinda er ½, þá er hægt að hugsa sér að hver þeirra snúist annað hvort réttsælis eða rangsælis um stefna segulsviðsins.
Aðeins tvær afstöður:
2S+1 = 2*½ + 1 = 2 eða ms = S, S-1,...,-S = +½ og -½

8. Fræði EPR
Eðlisfræði EPR litrófsgreiningar er í megin dráttum sú sama og í NMR.
Orkuþrep rafeindaspuna í segulsviðinu B eru:
Ems = gemBBms ms =  ½
þar sem mB er Bohr segulvægiseining og ge = 2,0023
Þessi jafna sýnir að orka a e- (ms = + ½) eykst en b e- (ms = - ½) minnkar þegar styrkur segulsviðsins er aukinn, og bilið á milli orkuþrepanna er
DE = Eb – Ea = gemBB
Ef sýnið örvast með rafsegulbylgju af tíðninni v, gildir:
hv = gemBB

9. Orkuástönd rafeindaspuna í segulsviði

10. Útlit EPR rófa
EPR róf eru í raun fyrsta afleiða eða hallatala af gleypni hvers punkts:
dA/dB
Útslag toppa ræðst af styrk radikala eða paramagnetísks efnis í sýninu.
Breidd toppa ræðst af aförvunartíma spunaástandsins.

11. Hyperfine structure
Orsök fyrir „hyperfine structure“ í EPR er víxlverkun á milli segla rafeindaspunans og segultvípólsvægis kjarnanna í radikalnum.
Radíkal með einn 14N kjarna (I = 1) og tvær jafngildar prótónur (I = ½) gæfi eftirfarandi „hyperfine structure“.

12. RNA rannsóknir
RNA (Ribonucleic acid) eru langar sykurfosfatskeðjur þar sem mismunandi niturbasar (A, U, G eða C) tengjast hverjum ríbósa.
RNA getur hvatað efnahvörf og samverkað á sérstakan hátt með öðrum stórsameindum, eins og t.d. próteinum.
Til að skilja hlutverk RNA þarf að ákvarða þrívíða byggingu þess. Að lesa út úr kristalsgreiningu flókinna RNA sameinda getur reynst mjög erfitt.
Því hafa aðrar aðferðir verið notaðar til að ákvarða stöðu eininga í RNA secondary byggingu (helixa, lykkjur o.fl.) í þrívíðu rúmi.
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) er hægt að nota til mæla langar fjarlægðir (35-85 Å).

13. Mikilvægi EPR í RNA rannsóknum
Með því að „merkja“ ákveðna niturbasa í RNA sameindinni er hægt að rannsaka gang hvarfa, þrívíða byggingu og samspil RNA við t.d. prótein eða málmjónir með EPR.
Mælingar hafa verið gerðar með 8-25 Å vegalengd á milli tveggja óparaðra rafeinda.
„Merkingarnar“ eru framkvæmdar með ýmsum efnasmíðum þannig að „merkti“ hópurinn hafi staka rafeind.
Þannig fæst aðeins eitt merki, sem getur jú verið margklofið, en þannig er hægt á einfaldan hátt að túlka einstakar niðurstöður ef merkt er á mismunandi stöðum í RNA sameindinni.

14. „Spuna merkingar“ á RNA
Nitroxíð spunamerki hefur verið innleitt í DNA annað hvort á niturbasa eða sykurfosfatskeðjuna.
Hins vegar eru einu aðferðirnar (2001) til að innleiða spunamerkið í RNA, á óparaðan uridine basa eða 5’-enda keðjunnar.
Aðferðirnar eru takmarkaðar því spunamerkið er ekki hægt að festa innvortis í basaparað tvístrennt RNA.
Margar sameindir hafa verið festar á 2´- kolefni hringsins í basapöruðum kjarnsýrum RNA.
Hægt er að nota 2’-amínó breytt RNA, sem hægt er að útbúa með því að nota ýmis algeng fosfóramíð.

15. „Spuna merkingar“ á RNA
Á þessari yfirlitsmynd er lýst hvernig festa má nitroxíð spunamerki á kolefni númer 2. Síðasta skrefið krefst DMF, formamide, borate buffer, pH 8.6, 90%

16. Tar RNA
Tar RNA er svæði í erfðaefni HIV sem í samvinnu við Tat prótein sér um umritun í eftirmyndunarferli HIV veirunnar.
TAR stendur fyrir Trans-Activation Responsive.
Fjögur spunamerkt Tar RNA voru útbúin, hvert þeirra með eitt spunamerki í stöðum U23, U25, U38 og U40.
U = Uridine

17. TAR RNA
A) TAR RNA
B) RNA sem vantar þriggja kirna lykkjuna sem er nauðsynleg fyrir Tat prótein bindingu.

18. Varmafræðilegar mælingar á RNA-unum
Niðurstöðurnar sýna að spunamerkingarnar hafa ekki mikil áhrif á secondary byggingu RNA

19. EPR litróf af spunamerktum Tar RNA-um
U38 og U40 eru svipuð róf og ættu að gefa góða mynd af öðrum EPR mælingum í „venjulega“ basapöruðu Tar RNA.
Niðurstöðurnar sýna að það er takmörkuð hreyfing spunamerkisins, óháð kjarnsýrunni, sem er forsenda rannsókna í gangfræði.

20. EPR litróf af spunamerktum Tar RNA-um
U23 og U25 rófin sýna greinilega meiri hreyfanleika (~ 40-falt) en U38 og U40.
Í raun er hreyfanleiki U23 og U25 svipaður og hjá einstrendu RNA.

21. Samverkan RNA við prótein og málmjónir
EPR litrófsgreining var notuð til að rannsaka breytingar í hreyfifræði spunamerktra kirna Tar RNA (U23, U25, U38 og U40) við bindingu á katjónum, argininamíði og tveimur peptíðum unnin úr Tat próteininu.

22. EPR litróf: TAR-Ca2+ og TAR-Na2+ tengi
Svarta rófið er án málmjóna, blárauða með Ca2+ og það blágræna með Na+.
EPR litrófsgreing sýnir breytingu í hreyfanleika U23, U25, U38 og U40 í viðurvist Ca2+ og Na+ jóna.

23. Tar-argininamíð tengi
NMR greining á HIV-2 Tar RNA bundið við argininamíð hefur gefið vísbendingu um sérhæfða samverkan arginine 52 (R52) og Tar RNA í bindingu við Tat próteinið.
Niðurstöður úr EPR: Lítil minnkun í hreyfanleika niturbasa U23 og U38. Hreyfanleiki U40 minnkaði mun meira en hreyfanleiki U25 jókst hins vegar.

24. Áhrif Tat afleiða á EPR litróf Tar RNA

25. Tar-Tat tengi
EPR róf voru tekin af þeim fjórum áðurgreindu Tar RNA-um í viðurvist bæði stökkbreyts (YKKKKRKKKKA) og náttúrulegrar gerðar (YGRKKRRQRRR) Tat-afleiddu peptíðanna.
Niðurstöður sýndu litla minnkun í hreyfanleika U23 og U38 en mun meiri minnkun hjá U40, í viðurvist stökkbreytta peptíðsins, á meðan hreyfanleiki U25 jókst.
Rófin fyrir U25 og U40 með náttúrulega peptíðinu eru svipuð og hjá því stökkbreytta á meðan mjög mikil lækkun er hjá U23 og U38.

26. Áhrif Tat afleiða á EPR litróf Tar RNA

27. Magnbundin greining úr EPR

28. Magnbundin áhrif katjóna á Tar RNA úr EPR
Ca2+ og Na+ hafa svipuð áhrif á Tar RNA.
Hreyfanleiki U23, U25 og U38 minnkar á meðan U40 eykst.
Argininamíð og stökkbreytt Tat (sem hefur a.s. R52) hafa svipuð áhrif á Tar RNA en hreyfanleiki U23 og U38 minnkar margfallt meira hjá náttúrulega peptíðinu en hjá því stökkbreytta.
Þetta bendir til að fleiri amínósýrur en arginine 52 taki þátt í bindingu við Tar RNA-ið.

29. Niðurstöður dregnar saman
Nitroxíð spunamerki er hægt að innleiða á ákveðna staði í RNA.
Spunamerkingarnar hafa ekki áhrif á stöðugleika RNA.
Umhverfi spunamerktu kirnanna hafa greinileg áhrif á EPR merkin.
Ca2+ og Na+ hafa svipuð áhrif á hreifanleika kirnanna.
Amínósýran arginine (R52) sem er bæði í argininamíði og stökkbreytta Tat peptíðinu spilar lykilhlutverk í tengingu við Tar RNA.
Niðurstöður sýna að fleiri amínósýrur í náttúrulega peptíðinu hafa einnig áhrif á tengingu við Tar RNA.