1. Genetika bakterija i bakteriofaga
dr Branka Vuković-Gačić, redovni profesor
dr Biljana Nikolić, vanredni profesor
Katedra za mikrobiologiju
Biološki fakultet Univerzitet u Beogradu

2. 3. Ekstrahromozomalni genetiČki elementi

3. Ekstrahromozomalni genetički elementi PLAZMIDI
Kod prokariota se, pored hromozoma, često nalaze i ekstrahromozomalni genetički elementi, plazmidi, transpozoni i virusi.
Plazmidi - autonomno se repliciraju i nose različite genetičke funkcije, koje mogu biti korisne za domaćina.
F faktor E. coli (epizomi) mogu se integrisati u hromozom.
Većina dvolančani, cirkularni DNK molekuli ali ima i linearnih.

4. PLAZMIDI
Otkriveno preko 1000 različitih plazmida (iz E. coli preko 300).
Veličina - od nekoliko hiljada bp (kbp) do nekoliko stotina hiljada bp. Postoje grupe sa sličnim sekvencama.
Nose gene koji povećavaju genetičku raznovrsnost i daju selektivnu prednost bakterijama koje ih poseduju:
- obezbeđuju rezistenciju na antibiotike,
- omogućavaju korišćenje neuobičajenih supstrata,
- predstavljaju faktore virulencije, gene čiji su produkti uključeni u invaziju i kolonizaciju eukariotskih ćelija, itd.

5. Osobine bakterija kodirane plazmidima
Osobina Rodovi bakterija
_____________________________________________________________________________
Produkcija:
- antibiotika (i rezistencija) Streptomyces
- bakteriocina (i rezistencija) enterične bakterije, Bacillus
- pigmenta Erwinia, Staphylococcus
- acetona i butanola Clostridium
- enterotoksina Escherichia
- koagulaze, hemolizina, fibrinolizin a Staphylococcus
- faktora invazije domaćina Yersinia, Salmonella, Shigella
Rezistencija:
- na antibiotike enterične bakterije, Staphylococcus
- na teške metale Pseudomonas
Degradacija:
- oktana, kamfora, naftalena Pseudomonas
- herbicida Alcaligenes
Korišćenje laktoze, glukoze, uree enterične bakterije
Konjugacija Escherichia, Pseudomonas, Vibrio
Adherencija za zube Streptococcus
Indukcija tumora kod biljaka Agrobacterium
Nodulacija i simbiotska fiksacija azota Rhizobium

6. Enteropatogeni sojevi E
Enteropatogeni sojevi E. coli kolonizuju tanko crevo i produkuju toksine koji dovode do simptoma dijareje.
- Kolonizacija zhvaljujući površinskom proteinu (colonization factor antigen, CFA), kodiranog genima plazmida, omogućava bakterijama da se prihvate za epitelijalne ćelije tankog creva.

7. Staphylococcus aureus - brojni enzimi i ekstracelularni proteini uključeni u virulenciju (koagulaze, hemolizini, fibrinolizini, enterotoksin) kodirani genima na plazmidu.
- Žuti pigment kod ove bakterije, kodiran plazmidom, verovatno je odgovoran za rezistenciju bakterija na destruktivno dejstvo reaktivnih vrsta kiseonika u fagocitu.

8. Ti plazmid kod Agrobacterium tumefaciens - indukuje formiranje tumora
Ti plazmid kod Agrobacterium tumefaciens - indukuje formiranje tumora. Koristi se kao vektor za prenos različitih gena u biljne ćelije. - Nastanak tumora je posledica prelaska dela plazmida, tzv. T-DNK, u hromozom biljne ćelije, što je omogućeno genima koji se nalaze na Ti plazmidu. - Na T-DNK se nalaze funkcionalni biljni promotori za sintezu hormona i formiranje tumora. - Transformisana biljka sintetiše i opine, (geni na Ti plazmidu), derivate arginina, koje bakterija koristi kao hranu. - Ćelije sa plazmidom imaju dodatni supstrat za rast (bolje preživljavanje).

9. PLAZMIDI - Replikacija
Autonomna replikacija - sopstveno mesto za početak replikacije (origin of replication - ori).
Koriste ćelijske proteine za različite procese, uključujući replikaciju DNK, transkripciju i translaciju svojih gena.
Broj kopija istog plazmida kontrolisan je genima na plazmidu (od 1-3 do preko 100).
Kod E. coli - F faktor (1-2 kopije po ćeliji) i pSC101 (10-15 kopija po ćeliji), ColE1 plazmid veliki broj kopija (oko 50 po ćeliji).

10. Replikacija plazmida
inc geni plazmida – kontrolišu replikaciju 2 različita plazmida u istoj ćeliji (Plazmidi jedne inkompatibilne grupe su srodni, isti ori region, međusobno su u kompeticiji, mogu koegzistirati sa plazmidima druge inkompatibilne grupe).
Plazmid kontroliše broj kopija i obezbeđuje da svaka ćerka ćelija dobije kopiju plazmida.
Replikacija na sličan način kao hromozom domaćina - bidirekciono, formira se teta () intermedijer (iznosi 1/10 vremena neophodnog za deobu ćelije).
Sledi mehanizam kotrljajućeg obruča, koji je nesimetričan i dovodi do nastanka jednolančanog intermedijera.

11. Inicijacija replikacije cirkularnih plazmida
Specifični plazmidni protein inicijator i/ili RNK molekula za ori sekvencu.
Ove komponente otvaraju DNK heliks na ili blizu ori sekvence, obezbeđujući mesta za sintezu prajmera i nastavak DNK replikacije.
Kod nekih plazmida inicijacija replikacije zahteva i DnaA protein domaćina.
Kada plazmidi koriste RNK molekul za inicijaciju, on istovremeno služi i kao prajmer za DNK polimerazu.

12. Linearni plazmidi
Izolovani iz bakterija roda Streptomyces (A) i Borrelia (B).
Linearni plazmidi repliciraju se mehanizmom koji uključuje vezivanje proteina za 5’ kraj svakog lanca, koji se koristi da zaštiti krajeve i omogući kompletiranje replikacije.
Plazmidi Borrelia imaju jednolančane krajeve, kovalentno vezane u strukturu ukosnice (hairpin), štiti od ćelijskih nukleaza i obezbeđuje početak replikacije (uloga prajmera).
(A) Racket frame structure- linear Streptomyces plasmids.
The black circles - the terminal protein attached to the 5’ ends, which is required to protect the ends and complete the replication of both plasmid termini.
The ovals - proteins that bring together the plasmid termini by binding to specific regions of palindromic symmetry.
The ori located near the center of the plasmid is depicted by the box and the arrows indicate the bidirectional DNA replication from this ori.
(B) Typical structure of linear plasmids from Borrelia containing terminal hairpin telomeric structures composed of inverted repeats (thick arrows) harboring the nick sites (vertical arrows) involved in DNA replication.

13. Konjugativni plazmidi
Procesom konjugacije se prenose iz ćelije u ćeliju (horizontalan prenos).
tra region na plazmidu - produkti neophodni za uspostavljanje kontakta između ćelija i prelazak plazmida.
Isecanje jednog lanac DNK koji prelazi u drugu ćeliju.
Ukoliko se plazmid integriše u hromozom domaćina, konjugacijom se može u drugu ćeliju preneti i bakterijski hromozom.
F plazmid (fertility factor)

14. Konjugacija Transfer plazmida

15. Konjugacija Transfer hromozoma
F plazmid – integracija u hromozom na većem broju mesta.
Prepoznavanje IS sekvenci – rekombinacija specifična za mesto.
Integracijom F plazmid formira se Hfr (High Frequency of Recombination) soj.
Konjugacijom sa Hfr sojem dolazi do prelaska hromozoma u ćeliju recipijenta.
Transfer kompletnog hromozoma domaćina (veoma redak) traje 100 min.
Proces se može koristiti u mapiranju gena na hromozomu

16. Konjugacija – transfer plazmida ili čitavog hromozoma

17. Konjugativni transfer cirkularnog replikona
Cirkularni plazmid (F) i cirkularni hromozom sa integrisanim F faktorom (Hfr) kod E. coli: proteini kodirani F faktorom dovode do zasecanja jednog lanca u oriT regionu F DNK. Zasecanje vrši TraI (transfer protein) koji se zatim kovalentno vezuje za 5' kraj zasečenog lanca; replikacija kotrljajućim obručom dovodi do dodavanja nukleotida na slobodni 3' kraj. Dolazi do istiskivanja lanca i njegovog transfera u ćeliju recipijenta (5’-kraj sa vezanim proteinom ulazi prvi u ćeliju). U Hfr ćelijama hromozomalnu DNK mobiliše integrisani F faktor, u ćeliju recipijenta exogenote ulazi vođen delom F sekvence.
exogenote - deo strane DNK koja se ubacuje u ćeliju recipijenta

19. Konjugativni transfer linearnog replikona
Linearni plazmidi i linearni hromozomi kod Streptomyces. Kao origin of transfer (oriT) koristi se 5’ kraj koji ima vezan terminalni protein (TP). Pretpostavljeni mehanizama je da 5’-TP služi kao prajmer, sa koga kreće replikacija lenearnog replikona koji se mobiliše i prebacuje u ćeliju recipijenta (mehanizam replikacije tokom konjugacije ne kreće sa središnjeg ori regiona, već sa 5’ kraja lanca). Linearni plazmid može da mobiliše druge linearne replikone (npr. linearni hromozom), ali ne i cirkularne replikone.
end first model: TP ima ključnu ulogu kao prajmer za otpočinjanje replikacije i lider protein koji se prebacuje u ćeliju recipijenta, povlačeći za sobom vezanu DNK

20. Mobilizacija nekonjugativnih plazmida
Mobilisani plazmidi - nekonjugativni plazmidi se mogu preneti procesom konjugacije ukoliko se u ćeliji nalaze zajedno sa konjugativnim plazmidom, od koga “pozajmljuju” neophodne proteine.
Nekonjugativni plazmidi se mogu uneti u ćeliju pomoću virusa (transdukcija) ili kao goli DNK molekuli (transformacija).
Lečenje (curing) – uklanjanje plazmida (spontano ili indukovano), posledica je inhibicije replikacije plazmida i progresivnog gubitka prilikom deoba ćelija.
interkalirajući agensi, kristal violet, SDS, UV zračenje

21. Transpozoni
Ne egzistiraju samostalno, delovi hromozoma ili plazmida, repliciraju se kao deo nekog drugog molekula DNK. Veličina - od nekoliko stotina do nekoliko hiljada bp.
Posebni genetički elementi, jer sami kontrolišu sopstvenu replikaciju.
Barbara Mek Klintok ih je otkrila radeći na kukuruzu (Zea mays).
Nazvala ih je jumping genes, bilo je potrebno 40 godina da bi se potpuno shvatio značaj njenog, za koje je godine dobila Nobelovu nagradu.
Prilikom prelaska sa mesta na mesto mogu dovesti do inaktivacije gena (insercione mutacije).
Transpozicija u okviru istog replikona dovodii do inverzija ili delecija (gubitka fragmenta DNK).
Generalno se mogu svrstati u DNK parazite.

22. Transpozoni pokazuju veliku raznovrsnost u pogledu građe i stepena kompleksnosti.
Otkriveni su kod prokariota i eukariota i imaju važnu ulogu u genetičkoj varijabilnosti.
Dve glavne grupe - Transpozoni klase I (retrotranspozoni) i klase II (Transpozoni u užem smislu).
Autonomno se premeštaju sa jednog mesta na hromozomu na drugo, ili sa jednog genetičkog elementa na drugi.

23. Plasmids are separate pieces of DNA found in some bacteria
Plasmids are separate pieces of DNA found in some bacteria. A piece of DNA from the bacterial chromosome (a transposon) can be added to a plasmid that is later injected into another bacterium, thus changing its genetic information (genome).
A segment of one chromosome can be transferred to another chromosome through the process of translocation. A gene can also be transposed to another site on a chromosome.

24. Transpozoni Transpozicija je kodirana enzimom transpozazom.
Transpozaza se vezuje se za krajeve transpozon i ciljnu sekvencu, seče fosfodiestarske veze , prebacuje transpozon i vezuje ga na novu, ciljnu lokaciju.
Mobilnost gena pomoću transpozona vodi promenjivosti genotipskih, ali često i fenotipskih karakteristika ćelije/organizma.
Gubljenje gena za transpozazu -dok se u ćeliji nalazi drugi transpozon koji može sintetisati enzim, mogu se premestiti na novu lokaciju.

25. Dve klase bakterijskih elemenata:. 1. insertion sekvence (IS elementi)
Dve klase bakterijskih elemenata: 1. insertion sekvence (IS elementi) 2. Tn elementi
IS elementi - Najjednostavnije građeni elementi ( bp), u hromozomima bakterija i njihovih virusa, i u plazmidima.
Mogu postojati samostalno ili biti sastavni deo transpozona.
Kodiraju samo proteine neophodne za transpoziciju, a na krajevima su invertovani ponovci (15-25 bp) neophodni za transpoziciju.
Obeležavaju se različitim brojevima, kod E. coli su dobro proučene IS1, IS10 i IS50.
Element
# in E. coli
# in F factor
IS1 8 -
IS2 5 1
IS3 2
IS4
Struktura insercione sekvence.
IR – terminalni invertovani ponovci.

26. Složenije građeni mobilni elementi transpozoni - composite transposons
Sadrže na krajevima po jednu IS.
Transpozicija je omogućena genima u okviru IS elementa.
U centralnom delu su geni za različite proteine (faktori virulencije ili rezistencija na antibiotike i teške metale).

28. Veoma dobro proučeni transpozoni ovog tipa su Tn5, sa IS50 na krajevima i Tn10 sa IS10 na krajevima.

29. Složenije građeni mobilni elementi
Prosti transpozoni - noncomposite transposons
Ne poseduju IS na krajevima, već samo invertovane ponovke (IR) npr. Tn3 i Tn7.

31. Tipovi transpozicije Prosta, konzervativna transpozicija
Invertovani ponovci - mesta za koja se vezuje transpozaza.
DNK na ciljnom mestu se iseca tako da se formiraju lepljivi krajevi.
Nakon ugrađivanja i povezivanja transpozona, prekidi se popunjavaju replikacijom.
Ugradnja (insercija) transpozona

32. Svaka transpozicija dovodi do duplikacije ciljne sekvence.

33. Tipovi transpozicije Replikativna transpozicija
U replikativnom mehanizmu transpozicije jedan lanac transpozona se umeće u ciljnu sekvencu, dok drugi ostaje na prvobitnoj poziciji.
Jednolančani delovi se repliciraju i formira se intermedijer tzv. kointegrat.
Pored transpozaze, ovaj proces zahteva i enzim resolvazu, koja mesto specifičnom rekombinacijom između dve kopije transpozona vrši tzv. rezoluciju kointegrata.
Replikativna transpozicija

36. Konjugativni transpozoni
Premeštaju se iz ćelije u ćeliju konjugacijom.
Nose gene tra regiona (pored gena neophodnih za transpoziciju), koji kodiraju proteine za transfer u drugu ćeliju i mogu mobilisati hromozom.
Imaju cirkularnu formu – izvlače se iz hromozoma, cirkularizuju i iniciraju konjugativni transfer u ćeliju recipijenta (podsećaju na konjugativne plazmide)
Integracija u hromozom nije tipična za transpozone, već je nalik integraciji epizoma (podsećaju na epizome)
Nemaju sposobnost autonomne replikacije i ne opstaju u ćeliji kao cirkularni intermedijeri (izvlače se i cirkularizuju samo u slučaju transfera), već se uvek integrišu u druge replikone (nalik drugim transpozonima)
Prilikom integracije ne dovode do dupliciranja ciljne sekvence kao ostali transpozoni.
Mechanism of conjugative transposition

38. Retrotranspozoni ↓ Retrotranspozon RNK intermedijer transkripcija
Kod eukariota - retrotranspozoni (transposons via RNA intermediates) se premeštaju replikativnim mehanizmom, ali imaju RNK intermedijer.
Novosintetisana kopija RNK se reverznom transkriptazom prepisuje u DNK i ugrađuje u genom.
Kao i DNK transpozoni, retrotranspozoni dovode do duplikacije sekvence na novom mestu insercije (po tome se zna da je određeni deo DNK poreklom od retrotranspozona).
Oko % ukupnog humanog genoma se sastoji od retrotranspozona.
Zajedničko evolutivno poreklo retrovirusa i retrotranspozona
Retrotranspozon ↓
RNK intermedijer
Dvolančani cDNK intermedijer
Insercija na nova mesta u genomu
transkripcija
reverzna transkripcija
prosta transpozicija

39. Retrotranspozoni
- Retrotranspozoni - transposons via RNA intermediates, umnožavaju se i sastavni su deo DNK mnogih eukariota.

40. Retrotranspozoni
Klasa I transpozona koja se kroz genom kreće mehanizmom copy and paste.
Mehanizam mobilnosti retrotranspozona uključuje:
- kopiranje segmenta DNK u RNK,
- transfer RNK kopije na target site,
- transkripciju RNK sekvence reverznom transkriptazom ponovo u DNK i
- inserciju gene na novu lokaciju u genomskoj DNK.
Na oba kraja retrotranspozona često se nalaze dugi terminalni ponovci , oko 1000 bp.
Ovi geni se lako amplifikuju unutar genoma tako da je zastupljenost retrotranspozona 50% u humanom genomu.
Virus AIDS, HIV i T-cell leukaemia virus imaju retrotranspozone u svojim RNK genomima koje mogu preneti u numanu DNK pomoću reverzne transkriptaze i integraze.
Enzim integraza ima funkciju kao i transpozaza Klase II transpozona.

41. Razlike između transpozona i retrotranspozona?
Transpozoni - klasa II
Enzim transpozaza.
Terminalni krajevi kraći
Postojanje oba mehanizma transpozicije: cut and paste i replikativnog
Nikada ne uključuju RNK intermedijer
Retrotranspozoni – klasa I
Enzimi - reverzna transkriptaza i integraza
Terminalni krajevi mnogo duži
Kopiraju se preko RNK i cDNK intermedijera i integrišu u ciljnu DNK sekvencu (mehanizam je obavezno replikativni).
Uključuju RNK intermedijer i reverznu transkripciju

42. OSTALI POKRETNI GENETIČKI ELEMENTI integroni, genske kasetei invertibilni genetički elementi
Integroni - genetički elementi na hromozomima bakterija, plazmidima i transpozonima.
Sadrže gene koji kodiraju integrazu, mesto za inserciju genskih kaseta i promotor koji omogućava ekspresiju ugrađenih gena.
Evolutivno poreklo integrona i genskih kaseta nije jasno.

43. OSTALI POKRETNI GENETIČKI ELEMENTI integroni, genske kasete i invertibilni genetički elementi
Genske kasete - sadrže gene za rezistenciju na antibiotike, ali se geni ne eksprimiraju jer ne poseduju sopstveni promotor.
Mogu biti inkorporisane u integron ili slobodne kao cirkularna DNK.
Oivičeni su sekvencama koje prepoznaju enzimi integraze, koji ih mesto specifičnom rekombinacijom mogu ugraditi u druge genetičke elemente, integrone, i tako im omogućiti ekspresiju.

45. OSTALI POKRETNI GENETIČKI ELEMENTI genske kasete, integroni i invertibilni genetički elementi
Sposobni za sopstvenu inverziju, tj. promenu orijentacije u hromozomu.
Podsećaju na IS elemente imaju invertovane ponovke na krajevima
Kodiraju enzim invertazu (Hin protein), koja katalizuje mesto specifičnu rekombinaciju između krajeva invertibilnog elementa.
Geni za Hin protein su homologi genima za resolvazu nekih transpozona, transpozoni i invertibilni genetički elementi imaju zajedničko poreklo.
Jedan od invertibilnih elemenata kod bakterije S. typhimurium je odgovoran za reverzibilne promene u strukturi flagela tzv. faznu varijaciju.

46. Postojanje genetičkih elemenata kao što su transpozoni, integroni i invetibilni elementi doprinosi velikoj dinamičnosti genoma prokariota i, zajedno sa mutacijama i mehanizmima razmene gena, omogućava promenljivost, adaptaciju i evoluciju.
Fazna varijacija kod S. typhimurium
Kada je invertibilni segment u jednoj orijentaciji, promotor za flagelin H2 se ne nalazi ispred strukturnog gena i nema njegove ekspresije. Flagelin H1 se sintetiše sa sopstvenog promotora na drugom mestu u hromozomu. Ukoliko se invertibilni element okrene, promotor je na korektnoj poziciji i transkribuju se geni za flagelin H2 i represor, koji sprečava transkripciju H1 gena.

48. Phase variation of type 1 fimbriae expression in E. coli.
Type 1 fimbriae phase variation is controlled by the invertible DNA element, fimS, which contains the promoter for the genes encoding structural fimbriae subunits (including fimA and fimH) and is flanked by two inverted repeat sequences: IRL and IRR. (In this diagram, IRL is the inverted version of IRR.).
When the switch is in the ON position, transcription of structural fim genes can be initiated because the promoter is in the appropriate orientation.
However, when the switch is inverted into the OFF position, the promoter points in the opposite direction and so no longer supports the expression of fimbriae components—leading to their rapid degradation.
The ON-to-OFF inversion of the switch is mediated by recombinases FimE and FimB, while the OFF-to-ON events are mediated by FimB.

50. Gram-negative bacteria are known to cause severe infections in both humans and animals. Antimicrobial resistance (AMR) in Gram-negative bacteria is a major challenge in the treatment of clinical infections globally due to the propensity of these organisms to rapidly develop resistance against antimicrobials in use.

51. Miniature Inverted Repeats Transposable Elements – MITE
Kod eukariota su nađeni i veoma mali transpozoni, sadrže invertovane ponovke od oko 15 bp (Miniature Inverted Repeats Transposable Elements – MITE).
MITE ne kodiraju ni jedan protein, pa se predpostavlja da se premeštaju uz pomoć većih transpozona, koji kodiraju neophodne enzime i prepoznaju iste invertovane ponovke.
MITE su nađeni kod ljudi, biljaka (pirinač, jabuke) i nekih drugih organizama.