1. Ćelijski i molekulski mehanizmi indukcije adaptivnog imunskog odgovora

2. Šta je cilj kursa molekularna i ćelijska imunobiologija?

3. Kognitivni procesi Zapamtiti Razumeti Primeniti Analizirati Evaluirati
Kreirati

4. Cilj
I deo – Prepoznavanje antigena u adaptivnoj imunosti, MHC molekuli, geni za MHC, obrada antigena i prezentacija u skolopu MHC
II deo - Organizacija gena za receptore za antigene na limfocitima i molekulski mehanizmi njihovog rearanžiranja, struktura receptora za antigene, prezentacija antigena T limfocitima i prepoznavanje

5. Ključne činjenice
Raznovrsnost prezentacije antigena posredstvom MHC klase I i II, je postignut na tri načina:
(1) gensko kodiranje MHC je poligensko,
(2) MHC geni su visoko polimorfnih i imaju puno varijanti
(3) više MHC geni su ispoljeni sa oba nasleđena alela.
Human MHC klase I i II se nazvani humani leukocitni antigen (HLA).
MHC geni su visoko polimorfni; to znači da postoje različiti aleli u različitim pojedincima unutar populacije.
Evolucija MHC polimorfizma osigurava da populacija neće podleći novom ili mutiranom patogenu, jer barem neki pojedinci će biti u stanju da razviju adekvatan imunski odgovor da bi eliminisao patogena.

6. Interakcija između prirodnog i adaptivnog imuniteta

7. Ključni molekuli i ćelije adaptivne imunosti
3 molekula
3 tipa ćelija
4 kardinalne odlike a V
B ćelije
T ćelije
Antigen prezentujuće ćelije DĆ
Makrofagi
B ćelije

8. Genetska osnova odbacivanja transplantata
Transplantacija tkiva između sojeva pokazuje da je
odbacivanje ili prihvatanje zavisno od
genetske osnove svakog soja
Inbredni sojevi miševa - svi geni su identični
Geni histokompatibilnosti: George Snell (1940)
=> tumori ili tkiva => istog soja, DA
=> različitih sojeva, NE

9. Imunogenetika odbacivanja transplantata
Roditeljski sojevi A B X
F1 GENERACIJA
(jedan set alela od svakog roditelja)
A x B
A x B
PRIHVATANJE A B
ODBACIVANJE
Miševi soja (A x B) su imunološki tolerantni na kožu A ili B soja
Koža (A x B) miševa poseduje antigene koje će biti prepoznati
od strane roditeljskih sojeva

10. Imunološka osnova odbacivanja transplantata
Primarno odbacivanje
strane kože
npr 10 dana
Lyc
Transfer limfocita
prajmovanog miša
6 meseci
Naïve miš
Sekundarno odbacivanje
strane kože
npr. 3 dana
Primarno odbacivanje
strane kože
npr 10 dana
Odbacivanje transplantata nastaje usled antigen-specifičnog imunskog odgovora sa imunološkom memorijom.

11. Odbacivanje transplantata
Prvi pokušaji transplantacije tkiva su bili neuspešni
Odbacivanje transplantiranog tkiva je posredovano mehanizmima inflamacije i infiltracije limfocita
ODBACIVANJE GRAFTA – IMUNSKI mehanizmi

12. Za njihova istraživanja koja su dovela do otkrića MHC
- Imunološko prepoznavanje
Temelji adaptivne imunosti
- Transplantacije

13. MHC molekuli dve klase Nema rearanžiranja i somatskih promena
Called major due to historical reasons acute versus chronic rejection of transplanted tissue
Nema rearanžiranja i somatskih promena
Raznovrsnost nastaje od 1) familija gena ) genskog polimorfizma

14. Struktura molekula MHC klase I
α 45 kDa
β2m 12kDa
α1, α2, α3 po 90 ak
25 ak
30 ak

15. Struktura molekula MHC klase II
α 33 kDa
β 28 kDa

16. na svakoj ćeliji sa jedrom obično je eksprimirano
ekspresija MHC
na svakoj ćeliji sa jedrom obično je eksprimirano
oko 105 kopija svake klase MHC I, na limfocitima najviše oko 1% ukupnih membranskih proteina tj oko 5 x 105
MHC II konstitutivno samo na APĆ, a inducibilno povećanje na B ćelijama i MF

17. Regulacija MHC ekspresije
1- Transkripciona regulacija:
MHC I i II geni imaju promotorske sekvence za koje se vezuju transkripcioni faktori (TF) koji ispoljavaju pozitivno i negativno dejstvo
*za promotor MHC II se vezuje MHC II transaktivator (CIITA) i RFX
2- Regulacija citokinima
IFN (α, β, γ) i TNF povećavaju ekspresiju MHC I.
IFN–γ indukuje
-stvarnje specifičnog TF za α lanac, β2m, LMP subjedinice proteazoma i TAP
-CIITA
IL-4 povećava MHCII na mirujućim B

18. MHC I klasa MHC II klasa 8-11 a.k. (9a.k. 100 -1000x afinitet)
10-30 a.k. (najčešće 13-18)

19. polimorfizam je u b1domenu
Polimorfne rezidue MHC molekula
U klasi I, polimorfne
rezidue a1a2 domena => formiraju peptid vezujući žleb
U klasi II, polimorfne
rezidue a1b1 domena => formiraju peptid vezujući žleb
U slučaju HLA-DR,
polimorfizam je u b1domenu

20. Svaka MHC izoforma vezuje karakterističan set peptida - Rezidue za usidravanje u peptidima su važne za vezivanje za MHC - Nisu sve rezidue važne
Hidrofobne ak
Primer rezidua za usidravanje u nanomernom peptidu koji se vezuje za MHC I klasu
u MHC II kontakt obezbeđuje 7-10 unutrašnjih centralnih AK od kojih su na N kraju aromatične ili hidrofobne i 3 dodatne hidrofobne na C kraju

21. Odlike peptid-MHC interakcija
MHC molekuli pokazuju širok spektar za vezivanje peptida, u poređenju sa velikom specifičnošću prepoznavanja Ag od strane At.
2. Peptide-MHC interakcije su nekovalente i posredovane su reziduama i na peptidu i u džepu MHC molekula.
3. Svaki MHC molekul vezuje se jedan peptid u jednom trenutku ali može da veže mnogo “različitih peptida”.
4. MHC molekuli NE MOGU da prave razliku između
“stranih peptida” & “sopstvenih peptida”.

22. hromozom 6
hromozom 17
MHC geni su najpolimorfniji geni prisutni u genomu čoveka
Serološka i molekularna tipizacija polimorfnost MHC

23. Shematska mapa MHC lokusa
same size as the entire genome of E. coli
Crossover: Haplotypes, normally, are inherited intact and hence antigens encoded by different loci are inherited together (e.g., A2; B27; Cw2; DPw6; DQw9; DRw2). However, on occasions, there is crossing over between two parental chromosomes, thereby resulting in new recombinant haplotypes. Thus, any one specificity encoded by one locus may combine with specificities from other loci. This results in vast heterogeneity in the MHC make-up in a given population.
poligeni (nekoliko nealelskih gena kodira produkte sa istom funkcijom)
2-mikroglobulin nije kodiran MHC lokusom već je na hromozomu 15
 i  lanac = genA i genB
Haplotip – kombinacija alela nasleđenih sa hromozoma 6

24. MHC kodira niz drugih gena
geni uključeni u obradu antigena
TAP1 i TAP2 - transporter za klasa I peptide
Tapasin – uključen u ubacivanje peptida u molekule klase I
LMP2 i LMP7 - inducibilne subjedinice proteazoma
HLA-DM (H-2M kod miša) i HLA-DO (H-2O) – kontrolišu ubacivanje peptida u molekule klase
Ekspresija gena (osim DOb) je koordinisano regulisana sa IFN-g indukcijom klasa II transaktivatora (CIITA)
Interferon , , i  indukuje Klasa I , 2M, TAP, LMP2, LMP7

25. MHC kodira niz drugih gena
Klasa I region: “Neklasični” klasa I molekuli (imaju homologu sekvencu, vezuju b2mikorglobulin, ali su nepolimorfni), označavaju se i kao klasa IB gena, a neki od njih su i pseudogeni
H2-M3 (mišji) vezuje N-formil peptide
MIC geni – njihovi produkti su eksprimirani sa niskim nivoom na epitelnim ćelijama, ali se ekspresija indukuje različitim stimulusima npr HSP. Interaguju sa aktivirajućim receptorima na NK (i nekim T) ćelijama
HLA-E i HLA-G interreaguju sa inhibitornim receptorima NK ćelija
HFE je uključen u metabolizam gvožđa

26. MHC kodira niz drugih gena
Klasa III region: mešovit asortiman gena – neki povezani sa imunskim odgovorm, drugi nisu
Komplement C4, C2, i faktor B
Faktor nekroze tumora (TNF) i IL-8
21-hidroksilaza (enzim uključen u biosintezu steroida) – mutacija u ovom genu dovodi do kongenitalne adrenalne hiperplazije
HSP

27. MHC geni su veoma polimorfni

28. MHC geni su veoma polimorfni
MHC polimorfizam garantuje dovoljan broj MHC molekula za prezentaciju različitih peptida u borbi protiv velikog broja mikroorganizama

29. MHC klasa I molekula predstavljaju ligande
CD8 T ili NK ćelije
NK ćelije
ostaju intracelularno
NK ćelije
MHC klasa I molekula predstavljaju ligande
za aktivaciju CD8 ćelija i inhibiciju NK ćelija

30. pomažu u ubacivanju peptida
prezentuju antigene peptide
CD4+ T ćelijama

31. Alelske varijacije se javljaju na specifičnim mestima u MHC molekulima

32. Poligenost i polimorfizam omogućavaju raznolikost MHC molekula
Zbog polimorfnosti retki su homozigoti za bilo koji MHC lokus

33. kodominantna ekspresija
polimorfizam
kodominantna ekspresija
Iako postoje hiljade kombinacija u populaciji*, postoje samo 4 kombinacije među braćom i sestrama
* HLA A ima 414 alela tako ima (414)2 = 171,396 mogućih kombinacija parova u vrsti (mada ne postoje sve kombinacije)

34. 6 različitih MHC I proteina na svim ćelijama
Majka: 3 MHC I gena
HLA-AM, HLA-BM, HLA-CM
Otac 3 MHC I gena
HLA-AP, HLA-BP, HLA-CP
6 različitih MHC I proteina na svim ćelijama
Heterozigoti
Majka: 3 MHC II gena
HLA-DPAM, HLA-DPBM
HLA-DQAM, HLA-DQBM
HLA-DRAM, HLA-DRBM
Otac: 3 MHC II gena
HLA-DPAP, HLA-DPBP
HLA-DQAP, HLA-DQBP
HLA-DRAP, HLA-DRBP
6 različitih MHC II proteina na svim ćelijama (neke osobe imaju 8 zbog dva HLA-DRB gena)

35. Rekombinacije gena stvaraju nove alele u MHC genina

36. Rekombinacije između alela istog gena
HLA B*5301-
nađen je u Afričkoj populaciji i povezan je sa otpornošću na tešku malariju
Rekombinacije između alela istog gena
Stvaranje novih
MHC alela

37. Rekombinacija između alela različitih gena
Figure 3-33 part 2 of 2
Rekombinacija između alela različitih gena
Stvaranje novih
MHC alela
HLA B*4601- nađen u populacijama u jugoistočnoj Aziji i povezan je sa osetljivošću za nazofaringealni karcinom

38. Veliki krug – ukupan broj različitih antigenih peptida koji mogu da se prikažu posredstvom MHCI & MHCII
Mali krug - ukupan broj različitih antigenih peptida koji mogu da se prikažu posredstvom haplotipa MHCI & MHCII jedne osobe

39. Prednosti heterozigotnih jedinki za MHC

42. Shematski dijagram MHC gena, mRNK i MHC molekula

43. MHC: činjenice za pamćenje
HLA-DR alfa lanac je monomorfan
HLA-DRB1 je najpolimorfniji od MHC II gena
HLA-DRB1 je uvek prisutan kod svih individua
Heterozigotne osobe (većina ljudi) eksprimiraju dva haplotipa
Osoba može da eksprimira 3-6 izoformi MHC I i izoformi MHC II.
2406 mogućih izoformi klase II kod ljudi
753 izoforme MHC I kod ljudi
[MHC izoforme]  [antigenim peptidima koje je moguće prikazati]

44. Y Y Y Y B ćelije prepoznaju nativne antigene,
a T ćelije ih ne prepoznaju Y B Y B
Cross-linking membranskih Ig
Proliferacija i produkcija antitela Y T Y T
Nema proliferacije
Nema oslobađanja citokina

45. Y Antigeni moraju biti obrađeni da bi ih T ćelije prepoznale T
Solublni
nativni Ag
Ćelijski
nativni Ag
Solublni
peptidniAg
Ćelijski
peptidniAg
Ćelijski peptidni Ag prikazani na ćelijama koje eksprimiraju MHC molekule
obrada antigena
Nema odgovora
T ćelija
Nema odgovora
T ćelija
T ćelijski
odgovor
Nema odgovora
T ćelija
Nema odgovora
T ćelija

46. Y Y Y Y Y Y Y Y MHC usmerava odgovor T ćelija prema stranim antigenima
MHC molekuli PRIKAZUJU strane antigene T limfocitima
Ćelije koje prezentuju antigene su ANTIGEN PREZENTUJUĆE ĆELIJE Y T Y T Y
Blokiranje
anti-MHC
antitelima Y T Y T Y T Y T Y T Ag Ag
Anti-Ag odgovor
Nema anti-Ag odgovora

47. MHC restrikcija citotoksičnih T ćelija

48. TCR prepoznaje kompleks antigeni peptid i MHC
MHC restrikcija
TCR prepoznaje kompleks antigeni peptid i MHC

49. =>MHC-restrikcija za prepoznavanje T ćelija => Adaptivna imunost
Za njihov rad koji je doveo do otkrića koje se odnosilo na specifičnost ćelijskog imuniteta
=>MHC-restrikcija za prepoznavanje T ćelija => Adaptivna imunost

50. Antigen prezentujuće ćelije (APĆ)
neophodne za prepoznavanje Ag od strane T ćelija
Profesionalne APĆ
Neprofesionalne APĆ
Dendritične ćelije
Fibroblasti (koža)
Makrofagi
Glijalne ćelije (mozak)
B limfociti
beta ćelije pankerasa
Timusne epitelne ćelije
Tiroidne epitelne ćelije
Vaskularne endotelne ćelije

51. Funkcija različitih APĆ

52. Odlike različitih APĆ

53. Dendritične ćelije (DĆ) najefekasnije APĆ
1. Locirane na uobičajenim mestima ulaska mikroba
2. Eksprimiraju receptore za prihvatanje mikroba.
3. Preferncijno migriraju u T ćeliske zone u limfnim čvorovima
4. Zrele DĆ eksprimiraju visok nivo kostimulatora
=> aktivacija T ćelija.

54. Pregled dendritičnih ćelija u prihvatanju i prezentaciji Ag
Četiri faze diferencijacije DĆ
Pre-DĆ
Monociti, Mo
Nezrele DĆ
Ingestija antigena
Ekspresija MHC
Sekrecija hemokina
Migracija
Zrele DĆ
Ekspresija visokog nivoa MHC I i II, CD80, CD86, CD40, CD54, HSP, dr.

55. Prepoznavanje antigena
Vezivanje i ingestija antigena
Zavisi od fizičkog stanja antigena i tipa ćelije
Obrada antigena
MHC I put obrade
MHC II put obrade
Prezentacija antigena

56. Vezivanje i ingestija antigena
egzogeni antigeni
bakterije, ćelije i solubilni proteini
obrada od strane APĆ
endogeni antigeni
produkovani u ćeliji, npr virusni ili tumorski proteini
obrada od strane ćelija domaćina
Nezrele DĆ
pinocitoza, receptor posredovana endocitoza, fagocitoza
Makrofagi
B ćelije
Nespecifična ingestija BCR posredovana

57. Dva različita tipa antigena: Ekstracelularni za MHC II i intracelularni za MHC I Obrada je različita

58. Obrada endocitovanih antigena za prikazivanje u sklopu MHC II molekula
Unošenje ekstracelularnih proteina u vezikularne kompartmane APĆ
Obrada internalizovanih proteina u endozomalnim i lizozomalnim vezikulama
Sinteza i transport MHC II molekula da endozoma
Vezivanje obrađenih peptida sa MHC II molekulima u vezikulama
Ekspresija kompleksa peptid - MHC II molekul na površini APĆ

59. Obrada Ag i prikazivanje u sklopu MHC II molekula (egzogeni put)

60. Ii lanac (CD74)
CLIP – Class II associated invariant chain peptid
HLA-DM (α i β lanac) katalizuje zamenu CLIP sa antigenim peptidima
HLA-DO se vezuje za HLA-DM i smanjuje njegovu efikasnost

61. Obrada citoplazmatskih antigena za prikazivanje u sklopu MHC I molekula
Izvori citoplazmatskih antigena
Proteolitička degradacija citoplazmatskih proteina
Transport peptida u endoplamatični retikulum (ER)
Formiranje peptida - MHC I kompleksa u ER
Površinska ekspresija peptid – MHC I kompleksa

62. Obrada Ag i prikazivanje u sklopu MHC I molekula (endogeni put)

63. Citoplazmatski proteolitički sistem
za degradaciju intracelularnih proteina
Normalna mašinerija za degradciju proteina radi regulacije nivoa proteina u eukariotskim ćelijama
Proteazom: proteinski kompleks oblika cevi sastavljen od 26 subjedinica
Koristi se i za degradciju intracelularnih proteina za prikazivanje u sklopu MHC I
Proteazomi za degradaciju peptida koji se ubacuju u MHC I sastavljeni od LMP2, LMP7 i LMP10 (ne-MHC protein) subjedinica

64. Transport citoplazmatskih peptida u ER Uloga transportera povezanog sa obradom antigena, TAP
Bare lymphocyte syndrome: nema ekspresije TAP  nema ekspresije MHC I expression  nema CD8 T ćelija  defektna citotoksična aktivnost prema virusom inficirani ćeljama hronična respiratorna infekcija
TAP=TAP1+TAP2
ATP-vezujući domen je u citoplazmi, to je ATP zavisan transport
Transportuju se peptidi od ak sa hidrofobnim ak na N kraju, za njih TAP ima najveći afinitet
MHC I ne može da napusti ER bez ugrađenog peptida

65. Foriranje kompleksa antigeni peptid - MHC I Molekulski šaperoni (kalneksin, kalretikulin i tapasin) pomoć u savijanju MHC I i ubacivanju peptida
U odsustvu infekcije, sopstveni peptidi prikazani u MHC, ali ne aktiviraju T ćelije
HSV protein inhibira funkciju TAP, adeno virusni protein inhibira ekspresiju MHC I

66. Fleksibilnost mesta za vezivanje antigenog peptida na MHC molekulu
MHC molekuli poseduju vezujuca mesta koja su fleksiblna u ranom intracelularnom stupnju sazrevanja
Floppy
Compact
Iako ovaj primer pokazuje MHC I molekul, fleksibilnost u peptid vezujućem mestu MHC II molekula takođe se pojavljuje u ranom stupnju maturacije u endoplazmatičnom retikulumu

67. Karakteristike puteva prerade antigena
Put MHC II
Put MHC I
Izvor proteinskih antigena
Endolizozomalni proteini
Citosolni proteini
Enzimi
Endozomalne i lizozomalne proteaze
Citosolne proteaze
Mesto ugradnje peptida MHC
Specijalizovani vezikularni odeljak ER
Molekuli uključeni u transport peptida i ugradnju MHC
Invarijabilni lanac, DM
TAP
Struktura antigen vezujućeg mesta
zatvoreni krajevi
otvoreno na oba kraja
Veličina antigenih peptida
8-11 AK
13-18 AK
Rezidue za usidravanje
na oba kraja peptida
celom dužinom peptida

68. Karakteristike vezivanja peptida za MHC molekule
Jedan MHC molekul veže samo jedan peptid tokom određenog vremena
Peptidi se ugrađuju u žleb tokom sinteze i sklapanja MHC molekula unutar ćelije
Vezivanje peptida za MHC je niskog afiniteta
Vezani peptid se sporo odvija MHC molekula
MHC molekul mora da sadrži oba lanca i da veže peptid da bi bio stabilan i da bi se ispoljio na membrani, “prazni” MHC se razgrađuje

69. Ćeliju inficiranu intraćelijskim mikroorganizmom (npr
Ćeliju inficiranu intraćelijskim mikroorganizmom (npr. virusom) fagocituje profesionalna APĆ
Antigeni virusa i sam virus se prikazuju u kompleksu sa MHC I molekulima T limfocitima
Zavisno od načina prerade, razgrađeni virus ili njegovi antigeni se povezuju u kompleks sa MHC molekulima I ili II klase.

70. Ukrštena prezentacija
Odnosi se na prikazivanje egzogenih antigena u sklopu MHC I molekula i mehanizam je za ćeliju da efikasno stimuliše CD8 T ćelije.
Tačan mehanizam nije jasan; predpostavljena su dva modela: recikliranje MHC I u endozomima ili fuzija ER sa ranim fagozoima/endozomima

71. 3. Prezentacija antigena
Aktivacija T ćelija preko T ćelijskog receptora, čija je specifičnost prepoznavanje linearnih antigenih peptida u sklopu MHC ili II molekula na površini profesionalnih APĆ.
Generalno CD8+ T ćelije prepoznaju endogene antigene i CD4+ T ćelije prepoznaju egzogene antigene
MHC molekuli vezuju više peptida, međutim T ćelije prepoznaju samo jedan peptid.

72. Neki virusi izbegavaju imunski odgovor inhibiranjem ili blokiranjem prezentacije antigena u molekulima MHC klase I

73. Superantigeni
MHC
superantigen
TCR

74. MHC klasa I molekula prezentuje antigene CD8+ T ćelijama,
MHC klasa II molekula prezentuje antigene CD4+ T ćelijama

75. Prezentacija patogena posredstvom MHC

76. Klinički aspekt značaja MHC molekula
(1) Transplantacija i odbacivanje transplantata
(2) Bolesti povezane sa specifičnim MHC antigenima
(3) MHC-vezane imunodeficijencije
(4) MHC i infektivne bolesti

77. MHC-vezane bolesti
Neki MHC aleli su povezani sa osetljivošću ili otpornošću na autoimunske bolesti
Defekti u ekspresiji MHC gena vode razvoju imunodeficiencija (MHC molekuli su neophodni za razvoj i aktivaciju T ćelija)

78. Autoimunske bolesti i MHC

79. MHC-vezane imunodeficijencije
Bare Lymphocyte Syndromes dovodi do gubitka ekspresije MHC molekula:
Defekt u TAP genima sprečava ekspresiju molekula MHC klase I (iako su MHC proteini normalni), tako da nema CD8+ T ćelija – iznenađujuće srednje teška imunodeficijencija (respiratorne i kožne infekcije)
Defekti u transkripcionim faktorima koji kontrolišu ekspresiju gena MHC II gena (CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP) blokira se razvoj CD4+ T ćelija - rezultat je SCID

80. Selekcija MHC molekula infektivnim bolestima
Patogeni se adaptiraju da izbegnu MHC - sadašnje MHC izoforme mogu da obezbede preživljavanje (otuda veća učestalost)
Epidemijske bolesti predstavljaju mesto opstanka i daju prednosti onima koji mogu najbolje da prezentuju patogene peptide
Samo manjina HLA alela su zajedničke za sve ljude - većina su skorašnje i specifične za etničke grupe

81. Korelacija je uglavnom sa HLA klasom I
Figure 3-34
Korelacija je uglavnom sa HLA klasom I
Almost all are associated with HLA class I - consistent with killing of virus infected cells by CD8 T cells.
Seroconversion - when antibodies have first been detected
Crveno – heterozigoti za sve visoko polimorfne HLA I i II
Žuto – Homozigoti za jedan lokus
Plavo – Homozigoti za dva ili tri lokusa

82. (engl. Human Leukocyte Antigen)
MHC
- ključni koncepti -
1. Prezentacija Ag TCR je posredovana pomoću dve klase MHC
molekula.
- Klasa I MHC => peptidi citoplazmatskih (intracelularnih)
proteina => CD8 T ćelije
- Klasa II MHC => peptidi ekstracelularnih (egzogenih)
fagocitovanih proteina => CD4 T ćelije
2. Kod ljudi, MHC su označeni i kao HLA
(engl. Human Leukocyte Antigen)
3. MHC geni su najpolimorfniji geni prisutni u genomu
i kodominantno se eksprimiraju kod svake osobe.
4. MHC molekuli se eksprimiraju na površini ćelije samo u prisustvu antigenih peptida
Klasa I => sve ćelije sa jedrom
Klasa II => APĆ