1. מהפכת ה PCR
We should amplify targets
I want to look up your genes

2. (reverse transciptase)
Overview of RT-PCR
tissue
extract RNA
copy into cDNA
(reverse transciptase)
do real-time PCR
analyze results

3. הכנת cDNA

4. אמפליפיקציה של RNA – התבטאות גנים
tissue
extract RNA
copy into cDNA
(reverse transciptase)
do quantitative PCR
analyze results

5. מה רע בגל אגרוז? מראה תוצאה סופית של התהליך תוצאות לא מבוטאות במספרים
איכותי ולא כמותי

6. חשיבות הקריאה בשלב האספוננציאלי
Traditional PCR
הכימות המדויק

7. ASSAYING COPY NUMBER: REAL-TIME PCR
Agarose Gel
Area for Real-time PCR detection
Traditional PCR detection
Problems with traditional end-point detection:
Low sensitivity
Low resolution
Poor precision

8. Readout
SYBR Green I
Currently, there are two available chemistries for the 7700/ We’ll describe both in brief.

9. SYBR Green Dye Assay Binds to any double-stranded DNA
- Specific product
- Non-specific product
- Primer dimers

10. Readout
TaqMan
Currently, there are two available chemistries for the 7700/ We’ll describe both in brief.

11. DNA Polymerase
5' Exonuclease Activity

12. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
In addition to the 5’ nuclease activity, TaqMan utilizes FRET or energy transfer. The 5’ reporter dye has a higher energy than the 3’ quencher dye. When the probe is intact, energy from the 5’ dye is transferred (energy flows down hill) to the 3’ dye. Thus, the intact probe has a low emission from the 5’ dye and high emission from the 3’ dye.
When the probe is cleaved, the distance between the two free dyes increases to the extent that the energy transfer cannot occur. Thus, the 5’ dye now has a greater emission than the 3’ dye.

14. TaqMan בשימוש Real Time PCR Polymerization causes Hydrolysis
TaqMan® Probe
Forward
Primer R Q 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’
Reverse
Primer

15. TaqMan בשימוש Real Time PCR5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’

16. Amplification Plot – Standard Curve
מיהולים כפולים

17. (reverse transciptase)
Overview of RT-PCR
tissue
extract RNA
copy into cDNA
(reverse transciptase)
do real-time PCR
analyze results

18. חשיבות הפריימרים ספציפיות יעילות ללא primer-dimers
לא נותן סיגנל שמקורו ב DNA
cross exon/exon boundary

19. פרימרים המבדילים בין DNA ל mRNA
EXON 1
INTRON 2
EXON 2
DNA
EXON 1
EXON 2
mRNA
EXON 1
EXON 2
mRNA

20. ביקורות ל RT-PCR איכות הדגימה – Reference mRNA
התבטאות (שווה בתאים שונים)
גודל (דומה ל mRNA הנבדק)
mRNA ולא DNA
בלי Alternative Splicing באזור הפריימרים

21. מניעת התחלה מוקדמת של פעילות בטמפרטורה נמוכה
Hot Start PCR
מניעת התחלה מוקדמת של פעילות בטמפרטורה נמוכה

22. Taq automatic hot start
Temperature Cycling
PCR Assembly
Initial Template
Denaturation
94oC, 30s - 3 min
Inactive Taq DNA Polymerase
Fully Active Taq DNA Polymerase

23. Hot start PCR