1. RT-PCR analysis 2009.2 생화학 실험 2 조교 : 이 선 민 내선 7699, kafka@yonsei.ac.krkafka@yonsei.ac.kr 첨단과학기술관 201-B 호 신과학원 S438 호

2. RT-PCR ? -Reverse transcriptase-polymerase chain reaction -single-stranded RNA is reverse transcribed into cDNA -for the detection and quantification of mRNA

3. Why we use RT-PCR ? Difference of Proteins… → Difference of Gene expression… → Difference of mRNA !!!

4. RT primer mRNA cDNA Target RNA target cDNA RNA(rRNA, tRNA 포함 ) cDNA

5. Genomic DNA contamination -Treat RNase free DNase -Select intron containing primer primer PCR product from mRNA PCR product from genomic DNA

6. Materials - DEPC-DW - 5X Buffer - 10mM dNTP - 10pM Oligo-dT - 0.1M DTT (reducing agent & Required for RNasin ) - RNasin (RNase inhibitor) - Reverse Transcriptase 200 units/ µl

7. Protocol O.D.260 = 1 RNA 농도 = 1 X 0.04(μg /μl) X 100(dilution fold) = 4 μg /μl 넣어야 할 RNA 양 = 5μg/4 (μg /μl) = 1.25 μl RNA 1.25 μl + oligo-dT 1ul + DW 8.75 μl =12 μl 260/280 = 1.8~2.0 RNA 정량

8. Protocol RNase contamination 주의 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 1.Quantitation of RNA by spectrophotometer.  1 OD260 unit equals 40ug/ml 2.RNA 1~2ug  transfer to fresh tube 3.Add oligo-dT 1ul 4.Add DEPC-DW until 11ul (total volume 11ul) 5.65’C for 5min and chill on ice 6.Spin down 7.Add :5x Buffer 4ul 12 ul 0.1M DTT2ul 6 ul RNasin1ul 3 ul dNTP1ul 3 ul 8.Incubate 2 min at 42’C 9.1ul of reverse-transcriptase 3x mix 8 ul mix add to each RNA sample

9. 10. Incubate 50min at 42’C 11. Kill the reaction by heating 15min at 70’C 12. Ready for PCR. (You can keep this cDNA at -20’C) 13. PCR using gene specific primer Protocol

10. Result GAPDH Gene A Gene BGene C 1. RNA 정량 결과 – OD. 값 RNA 농도 2. RT PCR 결과

11. 1. About quantitation of Nucleic acid…  why does the 1 OD 260 unit different between DNA(50ug/ml) and RNA(40ug/ml)? 2. RNasin is RNase inhibitor. What is the principal of their function? And search for other RNase inhibitors & explain their function(2~3 가지정도 ). 3. What is the quantitative real time RT-PCR? Further study

12. 보고서 제출 직접 써서 작성, 과학원 s438 호 앞 월요일반 :12 월 4 일 금요일 1 시까지 수요일반 :12 월 7 일 월요일 11 시까지 금요일반 :12 월 9 일 수요일 1 시까지 레포트 찾는 곳 : 과학원 s438 호 앞 12 월 11 일 금요일 이후 조교 : 이 선 민 내선 7699, kafka@yonsei.ac.krkafka@yonsei.ac.kr 첨단과학기술관 201-B 호 신과학원 S438 호