1. Fonctionnement de notre nouvelle Q-PCR

2. CFX96 de chez BioRad

3. Caractéristiques de la machine

4. Bloc chauffant Chauffage par effet Peltier, avec 6 modules thermiques
Bloc avec gradient de température : permet d’optimiser la température d’hybridation des amorces (24°C d’écart max sur les 8 lignes)
Bloc en nid d’abeille : pour diminuer la masse du bloc et augmenter la vitesse de la rampe de température (5°C/s et précision de 0,2°C)

5. Système optique
Bloc optique avec 6 LED et 6 photodiodes, donc possibilité de faire du multiplex 5 canaux (excitation/émission : nm)
Vitesse de passage de la navette : 12 sec pour 5 canaux, et sec pour un canal

6. Autres caractéristiques
Appareil autonome
Possibilité de faire de la Fast Q-PCR (prog. en 40 min)
Gamme dynamique de 10 log
Bloc 96 puits, avec possibilité de passage au format 384
Plastique : microplaque 96, barrette de 8, tubes individuels et possibilité de mettre autres consommables que BioRad
Volume échantillon : 1 à 50 µL (recommandé de 10 à 25 µL)
Module HRM (compris dans notre achat)
5 licences informatiques pour le logiciel
Accès aux formules de calcul dans l’aide

7. Manip de Q-PCR

8. Ce qu’il faut prévoir avant de lancer une manip de Q-PCR
Qualité des ARN et de la Reverse Transcription
Design spécifique des amorces
Tester les amorces et calculer l’efficacité de PCR pour ce couple d’amorce
Quantification absolue ou relative
Choix du gène de référence
Réplicats biologiques et réplicats techniques

9. Qualité des ARN
Les ARN ne se dégradent pas à la même vitesse et donc si notre ARN se dégrade plus vite que ceux du gène de référence, le rapport est faussé.
Vérifier la qualité des ARN sur gel d’agarose, au spectro avec les R260/280 et R260/230 ou mieux électrophorèse capillaire
ARNr 25s
ARNr 18s
ARNr chloroplastique
Smear d’ARNm
ARNt
Si R260/280 < 1,8 contamination par des protéines
Si R260/230 < 2 contamination par des glucides

10. Qualité de la RT Sensibilité différente selon les enzymes
Si RT avec activité ribonucléase : dégradation des ARNm au fur et à mesure de l’avancé de la RT
Détection des très faibles quantités d’ARNm

11. Design d’amorces Amplicon de 75 à 200 pb Amorces de 18 à 30 pb
Température d’annealing de ≈ 60 à 65°C
Tm des amorces proches (moins de 2°C entre les 2)
Entre 30 et 70% de GC
Un maximum de G/C dans les 5 premières bases et un maximum de A/T dans les 5 dernières bases
Limiter la répétition d’un même nucléotide (maxi 3)
Limiter les dimers d’amorces (logiciel PerlPrimer par ex.)
Limiter les structures secondaires (logiciel mfold par ex.)
Vérifier la spécificité des amorces par BLAST

12. PerlPrimer
Analyse des dimérisations possibles entre les amorces

13. Design d’amorces Amplicon de 75 à 200 pb Amorces de 18 à 30 pb
Température d’annealing de ≈ 60 à 65°C
Tm des amorces proches (moins de 2°C entre les 2)
Entre 30 et 70% de GC
Un maximum de G/C dans les 5 premières bases et un maximum de A/T dans les 5 dernières bases
Limiter la répétition d’un même nucléotide (maxi 3)
Limiter les dimers d’amorces (logiciel PerlPrimer par ex.)
Limiter les structures secondaires (logiciel mfold par ex.)
Vérifier la spécificité des amorces par BLAST

14. mfold

15. Design d’amorces Amplicon de 75 à 200 pb Amorces de 18 à 30 pb
Température d’annealing de ≈ 60 à 65°C
Tm des amorces proches (moins de 2°C entre les 2)
Entre 30 et 70% de GC
Un maximum de G/C dans les 5 premières bases et un maximum de A/T dans les 5 dernières bases
Limiter la répétition d’un même nucléotide (maxi 3)
Limiter les dimers d’amorces (logiciel PerlPrimer par ex.)
Limiter les structures secondaires (logiciel mFold par ex.)
Vérifier la spécificité des amorces par BLAST

16. Pour valider un couple d’amorces
Calculer l’efficacité d’amplification du couple d’amorce avec une gamme standard
La pente de la droite donne l’efficacité de la PCR pour ce couple : N = N0 x En
Si proche de 100% : N = N0 x 2n
Dilution de l’ADN pour avoir une gamme avec 4 ou 5 points

17. Pour valider un couple d’amorces
Vérifier que le couple d’amorce ne forme qu’un produit d’amplification, avec la melting curve :

18. Quantification absolue ou quantification relative
c’est plus avec ADNg pour déterminer le nombre de copie dans X ng d’ADN.
Quantification relative :
On compare l’expression, par ex. entre des traitements par rapport au témoin ou bien entre différents tissus.

19. Choix du gène de référence
C’est un gène qui s’exprime tout le temps et dont le niveau d’expression ne varie pas en fonction des conditions expérimentales utilisées.
On en utilise souvent plusieurs et on voit celui qui varie le moins en fonction de notre expérience.

20. Les réplicats
Réplicats biologiques : plusieurs témoins, plusieurs individus ayant subit le traitement A,…
Cela permet de montrer que la différence d’expression du gène est bien dû au traitement et non à un individu bizarre.
Réplicats techniques : on dépose 2 ou 3 fois le même échantillons à chaque fois (duplicat ou triplicat technique)…
Cela permet de normaliser le pipetage et de s’assurer encore une fois que la différence est dû au traitement et pas à un mauvais pipetage.

21. exemple Étude du gène 1 Gamme en 4 points pour calculer l’efficacité
3 traitements A, B, C + 1 témoin (4 conditions expérimentales)
Penser aux NTC et aux NRT
Donc il faut penser aux gènes de ménage (par ex. l’actine et GAPdH), à la gamme pour chaque gène, aux réplicats biologiques (4 individus pour chaque traitement), aux réplicats techniques (triplicat) et aux témoins négatifs :
Pour les gammes : 4 x 3 x 3 = 36
Pour l’expérience : 4 x 4 x 3 x x 3 = 159
Total : 195 puits, soit plus de 2 plaques 96

22. Optimisation
Optimiser la plus haute température pour l’annealing des amorces
Polymérase Hot Start (que 3 min si couplage avec Ac)
Minimiser le temps de dénaturation
Hybridation/élongation en une étape
Plastique blanc renvoie plus fluorescence donc meilleure sensibilité (jusqu’à 2 Ct d’écart)
Nouvelle chimie FAST
PCR

23. Fonctionnement du logiciel
CFX96 de BioRad
Fonctionnement du logiciel
CFX Manager

25. On commence par remplir le protocole

26. Si
On peut bien sûr modifier ce protocole

27. Ajouter une melting curve et la modifier si nécessaire

28. Puis on remplit le plan de plaque

29. Si

30. Si
Il faut bien remplir le plan de plaque

31. Il faut sélectionner le fluorophoreet
le type d’échantillon

32. Donner le nom du gène,
le nom de l’échantillon,
le nombre de réplicat

33. Et on peut lancer le RUN