1. Institut für Laboratoriumsmedizin, Klinische Chemie und Molekulare Diagnostik Bestimmung von Steroidhormonen in Serum mit LC-MS/MS- von der Methodenentwicklung bis zur Routinetauglichkeit von der Methodenentwicklung bis zur Routinetauglichkeit Linda Kortz 6. LC-MS/MS Anwendertreffen Tutzing

2. Zielstellung meiner Arbeit - simultane Bestimmung von klinisch relevanten Steroidhormonen aus Serum - schnelle, robuste Methode mit integrierter Probenvorbereitung - LC-MS/MS Setup sollte für andere Anwendungen adaptierbar sein (z.B. Immunsuppressiva) Einleitung

3. Analytisches Target: Steroidhormone OH HO OH H HH Estriol O O HO OH O HH H O OH O OH H HH O HO H HH O O S O O HO H HH O O H HH O OH H HH O OH O OH HO H HH OH HO H HH 11-Deoxycortisol DHEAS Androstendion DHEA Cortisol Testosteron Aldosteron β-Estradiol Androgene Mineralcorticoid Estrogene Glucocorticoid HO HH H HO O H HH HO OH O H HH O OH O HH H O O H HH Progesteron 17-OH-Pregnenolon 17-OH-Progesteron Cholesterol Pregnenolon Einleitung

4. Immunoassay vs. LC-MS/MS Immunoassay ist die Routinemethode für die klinisch- chem. Diagnostik von Steroidhormonen, aber...... für jeden Analyt ist ein eigener Assay erforderlich.... oft mangelt es an Spezifität. Einleitung

5. Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle Gliederung

6. Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle -Lösungsmittelqualität Gliederung

7. Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle -Lösungsmittelqualität -Deuterierte Standards Gliederung

8. Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle -Lösungsmittelqualität -Deuterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle HPLC Gliederung

9. LC-MS/MS von Steroidhormonen Geräte-Konfiguration HPLC: Shimadzu Prominence MS/MS: 4000 QTrap Gerätekonfiguration

10. Q1 Spektrum von 17-OHP [M+H] + [M+H-H 2 O] + 200250300350400450 m/z, amu 1.0e6 5.0e6 9.0e6 Intensität, cps 331.3 313.3 APCI - Steroidspezifische Bildung von M+H + und M+H-H 2 O + Spezies, zusätzl. M-H - Ionisierung Steroide bilden M+H + / M+H-H 2 O + Molekülionen Bsp.: 17-OHP

11. Q1 Spektrum von 17-OHP [M+H] + [M+H-H 2 O] + 200250300350400450 m/z, amu 1.0e6 5.0e6 9.0e6 Intensität, cps 331.3 313.3 APCI - Steroidspezifische Bildung von M+H + und M+H-H 2 O + Spezies, zusätzl. M-H - - charakteristische Fragmente: m/z 97 bzw. 109 Ionisierung Steroide bilden M+H + / M+H-H 2 O + Molekülionen Bsp.: 17-OHP

12. Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? ESIAPCIAPPI Spezies S/N EstradiolM+H-H 2 O + ---247 DHEAM+H-H 2 O + ---185 DHEASM+H-H 2 SO 4 + ---184 AndrostendionM+H + 371815 TestosteronM+H + 694830 ProgesteronM+H + 495819 17-OHPM+H + 163320 11-DeoxycortisolM+H + 2395 AldosteronM+H + ---5 CortisolM+H + 96--- EstradiolM-H - ---3745 AldosteronM-H - ---1916 Standard-Mix c= 1 ng/mL (30 µL Injektion auf Trennsäule) Ionisierung

13. Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? ESIAPCIAPPI Spezies S/N EstradiolM+H-H 2 O + ---247 DHEAM+H-H 2 O + ---185 DHEASM+H-H 2 SO 4 + ---184 AndrostendionM+H + 371815 TestosteronM+H + 694830 ProgesteronM+H + 495819 17-OHPM+H + 163320 11-DeoxycortisolM+H + 2395 AldosteronM+H + ---5 CortisolM+H + 96--- EstradiolM-H - ---3745 AldosteronM-H - ---1916 Standard-Mix c= 1 ng/mL (30 µL Injektion auf Trennsäule) Ionisierung

14. Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? ESIAPCIAPPI Spezies S/N EstradiolM+H-H 2 O + ---247 DHEAM+H-H 2 O + ---185 DHEASM+H-H 2 SO 4 + ---184 AndrostendionM+H + 371815 TestosteronM+H + 694830 ProgesteronM+H + 495819 17-OHPM+H + 163320 11-DeoxycortisolM+H + 2395 AldosteronM+H + ---5 CortisolM+H + 96--- EstradiolM-H - ---3745 AldosteronM-H - ---1916 Standard-Mix c= 1 ng/mL (30 µL Injektion auf Trennsäule) Ionisierung

15. Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? APCI ist guter Kompromiss! ESIAPCIAPPI Spezies S/N EstradiolM+H-H 2 O + ---247 DHEAM+H-H 2 O + ---185 DHEASM+H-H 2 SO 4 + ---184 AndrostendionM+H + 371815 TestosteronM+H + 694830 ProgesteronM+H + 495819 17-OHPM+H + 163320 11-DeoxycortisolM+H + 2395 AldosteronM+H + ---5 CortisolM+H + 96--- EstradiolM-H - ---3745 AldosteronM-H - ---1916 Standard-Mix c= 1 ng/mL (30 µL Injektion auf Trennsäule) Ionisierung

16. Aspekte der LC-MS/MS- Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle  -Lösungsmittelqualität -Deuterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle HPLC Gliederung

17. Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! APCI, injiziert wurden 40 µL 10 Mix 1 ng/mL auf die Trennsäule 0.00E+00 2.00E+04 4.00E+04 6.00E+04 8.00E+04 1.00E+05 1.20E+05 Estradiol Cortisol Androstendion 11-Deoxycortisol Testosteron 17-OHP DHEA DHEAS Aldosteron Progesteron Signalflächen gradient grade A Lösungsmittel MeOH

18. Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! APCI, injiziert wurden 40 µL 10 Mix 1 ng/mL auf die Trennsäule 0.00E+00 2.00E+04 4.00E+04 6.00E+04 8.00E+04 1.00E+05 1.20E+05 Estradiol Cortisol Androstendion 11-Deoxycortisol Testosteron 17-OHP DHEA DHEAS Aldosteron Progesteron Signalflächen gradient grade B gradient grade A Lösungsmittel MeOH

19. Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! APCI, injiziert wurden 40 µL 10 Mix 1 ng/mL auf die Trennsäule 0.00E+00 2.00E+04 4.00E+04 6.00E+04 8.00E+04 1.00E+05 1.20E+05 Estradiol Cortisol Androstendion 11-Deoxycortisol Testosteron 17-OHP DHEA DHEAS Aldosteron Progesteron Signalflächen LC-MS B LC-MS A gradient grade B gradient grade A Lösungsmittel MeOH

20. Aspekte der LC-MS/MS- Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle  -Lösungsmittelqualität  -Deuterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle HPLC Gliederung

21. Deuterierte Standards zeigen H/D- Austausch Q1 APCI, 550 °C, 1.5 mL/min MeOH/H 2 O 50/50 (v/v) 294 287 O O D D D D D DD [M+H] + Androstendion-d7 [M+H] + Androstendion Deuterierte Standards

22. Deuterierte Standards zeigen H/D- Austausch Q1 APCI, 550 °C, 1.5 mL/min MeOH/H 2 O 50/50 (v/v) Q1 ESI, Raumtemperatur 10 µL/min MeOH/H2O 50/50 (v/v) 294 287 O O D D D D D DD [M+H] + Androstendion-d7 [M+H] + Androstendion Deuterierte Standards

23. Stabile deuterierte Standards Deuterierte Standards Cortisol-d4 Estradiol-d3 Testosteron-d3 Androstendion-d7

24. Aspekte der LC-MS/MS- Methodenentwicklung -Wahl der Ionenquelle  -Lösungsmittelqualität  -Deuterierte Standards  - Probenvorbereitung und schnelle HPLC Gliederung

25. Monolithische Trennsäule ermöglicht schnelle HPLC bei normalem Druck APCI positiv HPLC

26. Limitierung: gleichzeitige Quantifizierung von DHEAS und DHEA in Realproben [µg/L] DHEAS 107 - 6390 DHEA 0,1 -12,5 Referenzbereiche Serum (ILM) HPLC

27. Limitierung: gleichzeitige Quantifizierung von DHEAS und DHEA in Realproben [µg/L] DHEAS 107 - 6390 DHEA 0,1 -12,5 Referenzbereiche Serum (ILM) O HO H HH O O S O O HO H HH DHEAS DHEA M+H-H 2 SO 4 + m/z 271 M+H-H 2 O + m/z 271 Intensivster MRM: 271/213 HPLC

28. Limitierung: gleichzeitige Quantifizierung von DHEAS und DHEA in Realproben [µg/L] DHEAS 107 - 6390 DHEA 0,1 -12,5 Referenzbereiche Serum (ILM) - Weniger intensiver MRM für DHEAS nötig, da am Sättigungsbereich des Detektors - DHEA kann in Patientenproben von DHEAS-Signal überlagert werden O HO H HH O O S O O HO H HH DHEAS DHEA Entscheidung für klinisch relevantes DHEAS M+H-H 2 SO 4 + m/z 271 M+H-H 2 O + m/z 271 Intensivster MRM: 271/213 HPLC

29. Einfache und automatisierte Probenvorbereitung 1. Proteinfällung mit MeOH/ZnSO 4 Probenvorbereitung

30. Einfache und automatisierte Probenvorbereitung 1. Proteinfällung mit MeOH/ZnSO 4 2. On-line SPE Injektion Elution Autosampler Isokratische Pumpe Abfall Binäre Pumpe MS/MS Trennsäule SPE-Vorsäule Probenvorbereitung

31. 0.20.61.01.41.82.22.63.03.43.8 0.0 0.6 1.0 1.4 Intensitäti x 10 5, cps Poros 0.2 1.8 2.2 0.20.61.01.41.82.22.63.03.43.8 0.5 0.7 Intensität x 10 5, cps 0.0 0.1 0.3 Cyclone 0.20.61.01.41.82.22.63.03.43.8 0.0 0.4 0.6 Zeit, min 0.20.61.01.41.82.22.63.03.4 3.8 0.2 Intensität x 10 5, cps Oasis HLB Poros R1, 2.1-30 mm, 4000 Å, Applied Biosystems Cyclone, 1.0-50 mm, 100 Å Cohesive Technologies Oasis HLB, 1.0-50 mm, 80 Å, Waters SPE-Säulen -Vergleich - Desorptionsprofile Probenvorbereitung

32. On-line SPE-LC-MS/MS für Steroidhormone Zeit, min 0.51.01.52.02.53.03.5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Intensität x 10 5, cps APCI positiv DHEAS Estriol Cortisol Aldosteron Androstendion β-Estradiol Testosteron 17-OH-Progesteron Progesteron Pregnenolon 11-Deoxycortiosol 17-OH-Pregnenolon DHEA Zeit, min 0.51.01.52.02.53.03.5 0.0 0.5 1.0 1.5 Intensität x 10 5, cps 1.8 APCI negativ Aldosteron Estriol β-Estradiol Clin Chem Acta submitted on-line SPE-LC-MS/MS

33. Zusammenfassung -Die APCI ist für die Ionisierung bei der Messung eines Steroidprofils ein geeigneter Kompromiss. -Die Lösungsmittelqualität spielt eine nicht zu unterschätzende Rolle für die Ionisierung. -Der Bedarf für unter Quellenbedingungen stabilen deuterierten Standards ist gegeben. - Die Kombination aus on-line SPE und chromatographischer Trennung auf einer monolithischen Säule ermöglicht eine schnelle und effiziente Analytik mit einer Methodenlaufzeit von 4 min ausgehend von 100 µL Serum.

34. Ausblick -Für die Routineanalytik fehlen noch kommerziell erhältliche Kalibratoren und Kontrollen für LC-MS/MS. -Die Methode lief bisher in Batch-Ansätzen. Noch offen ist, wie die Methode über den Zeitraum von einem Jahr läuft, sowie die Adaptierbarkeit anderer Applikationen. -Die on-line SPE-LC-MS/MS für Steroidhormone wird zukünftig in Leipzig für Routinemessungen eingesetzt.

35. Danksagung ILM Leipzig Dr. Uta Ceglarek Dipl.-Chem. Sven Baumann Babette Niescher Dr. Martin Fiedler Prof. Dr. Jürgen Kratzsch Prof. Dr. Joachim Thiery Institut für Analytische Chemie, Uni Leipzig Prof. Dr. Stefan Berger Applied Biosystems Dr. Jan Lembcke, Dr. Roland Geyer