Blood Group reagent evaluation Dr.Atoosa Shariat Torbaghani Reference Health Laboratory

Universal precautions HIV HBV

Appearance NO……. hemolysis Precipitate Particle Gel-formation ………………… in inspection

Contamination Culture must be negative Using validate process to produce Preservative Sterile filter

Anti A & B potency Testing Prepare new saline contain 1-2% albumin Two fold dilution of reagent with saline- one tube neg after it( 1/512) Wash cells -at least twice 2% suspension RBC with saline(A cell & B cell) 0.1 ml serum dilution+0.1ml RBC (10*75 mm tube) Shake gently Incubate 5 min at RT(20-30c) Centrifuge (15 sec /1000 g ) and grade (1+ to 4+) The greatest dilution which gives 1+ agglutination(small clumps macroscopically)

Anti A & B Acceptable 1/128  A1 , B , A 1B 1/64  A 2 B , A 2 Or = Reference Reagent

بررسی Potency برای رقیق سازی باید از لوله ای شروع کرد که آنتی سرم رقیق نشده و سپس با رقیق سازی 12/1 ، 4/1 ، 8/1 ...... ادامه داد. برای رقیق سازی، از سالین ایزوتونیک حاوی آلبومین 2-1 % استفاده شود. لوله آزمایش75 mm 12× یا بزرگتر به کار برید تیتراسیون را تا جائی که به نتیجه منفی برسید ادامه دهید تیتراسیون را با آنتی سرم رفرانس به طور همزمان ، مطابق روشی یکسان انجام دهید برای جلوگیری از carry over بهتر است سر سمپلرها را برای هر رقت ، تعویض نمائید. جهت کنترل ایزوتون ، آخرین لوله را با ایزوتون بدون آنتی سرم پر نمائید.

تهیه سوسپانسیون گلبول قرمز در صورت استفاده از سلول منجمد ، روش کار دقیقی برای فریز کردن و ذخیره کردن و آب کردن و مصرف مجدد آن، تهیه گردد.همچنین بعد از آب شدن ، روشی برای کنترل کیفیت سلولهای قرمز تدوین گردد. گلبولهای قرمز را حداقل دو بار با سالین شستشو دهید .( تا حدی که مایع رویی شفاف گردد) سوسپانسیون 2% از سلول pack شده با سالین حاوی 2-1% آلبومین تهیه کنید.

حداقل سلولهائی که برای آزمایش potency لازم میباشد Reagent Red Blood Cells Anti-A A1 and 3 different A2B * Anti-B A1 and A1B Anti-A,B A1 and A2** and B *سلول A2B یعنی سلول AB که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد **سلول A2 یعنی سلول A که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد

روش انجام کار برای بررسی potency 1 میلی لیتر از معرف آنتی سرم را در لوله آزمایش ریخته و رقت سریال تهیه کنید طوری که در هر لوله آزمایش 0.1 میلی لیتر آنتی سرم باشد 0.1 میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی ( محلول 2% گلبول قرمز که با ایزوتون حاوی 2% آلبومین تهیه شده) را به هر لوله اضافه کنید محتویات لوله ها را به خوبی مخلوط کنید. 5 دقیقه در حرارت اطاق ( 30-20 درجه سانتیگراد) انکوبه کرده سپس با دور rpm 1000(100-125 rcf) به مدت یک دقیقه و یا 3400 rpm به مدت 15 ثانیه (900-1000 rcf ) سانتریفوژ کنید

نحوه تفسیر نتایج سلول ته لوله را به آرامی تکان دهید تا جدا شود و ماکروسکوپی بررسی نمائید. واکنش را به روش زیر درجه بندی نمائید: +4 توده سلولی به صورت یک تکه باقی بماند. +3 توده سلولی به چند قطعه بزرگ خرد شود +2 توده سلولی به چندین قطعه کوچک مساوی خرد شود +1 توده سلولی به ذرات ریز قابل مشاهده خرد شود .D توده سلولی به ذرات ریز غیر قابل مشخص خرد شده است. برای درجه بندی این آزما یش خاص بهتر است موارد مشکوک را منفی گزارش کنید. واکنش منفی به مواردی اطلاق میشود که توده سلولی طوری باز شود که کلامپ سلولی دیده نشود آخرین لوله ای که واکنش +1 دارد به عنوان تیتر potency در نظر گرفته شود رقیق سازی تا حداقل ، یک لوله بعد از endpoint ادامه داشته باشد لوله آنتی سرم بدون سلول باید منفی شود.

ارزش تیتر بدست آمده آنتی سرم های ABO حد اقل تیتری مساوی تیتر آنتی سرم رفرانس داشته باشد

FDA & WHO برای anti-A از استاندارد 03/188 با رقت 1/8 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد برای anti-B از استاندارد 03/164 با رقت 1/4 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد

Anti A & B Avidity(BOB) 10% saline suspension of A&B cell (once washed) 100λ cell+100λ serum(slide area 25mm) Time record beginning agglutination(T<25˚C) Serum Cell beginning time(seconds) Anti-A A1 15 A2 30 A1B 30 A2B 45 Anti-B B 15 Macroscopic clump(1mm2) before 3 minutes

بررسی Avidity رقت 2/1 را با مخلوط کردن مقادیر مساوی آنتی سرم مورد آزمایش و سرم AB که فاقد آنتی بادی میباشد و یا با هر رقیق کننده ای که سازنده توصیه کند ، تهیه کنید گلبول قرمز را سازنده ، مطابق روشهای خود تهیه کند

حداقل سلولهائی که برای آزمایش Avidity لازم میباشد Reagent Red Blood Cells Anti-A A1 and A2B * Anti-B B and A1B Anti-A.B A1 , A2 ** , B , and Ax*** *سلول A2B یعنی سلول AB که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد **سلول A2 یعنی سلول A که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد *** سلول Ax یعنی سلول variant A در صورتیکه سازنده توصیه کرده آنتی سرمش با سلول A ضعیف هم واکنش دارد

انجام آزمایش آزمایش را با آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده به روش اسلاید انجام دهید. نتیجه آزمایش را در زمان ادعا شده توسط سازنده و همچنین در نصف زمان فوق ، یادداشت کنید.

نتایج آزمایش : نشانه های آگلوتیناسیون، در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده درپایان نیمه اول زمان واکنش ( که توسط سازنده ادعا شده بود )باید مشاهده شود. آگلوتیناسیون واضح ،در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده، درپایان زمان واکنش ، به صورت توده کمتر و یا بزرگتر از یک میلیمتر گزارش گردد

Anti A & B Specificity Anti-A A1-A2B(3) Anti-B A1B(3)-B Anti-AB Confirm reaction with A,B,AB At least 2+ reaction B. Confirm absence of reaction with panel cell due to Ab contamination D,C,E,c,e,cw,k,R,Kpa,Kpb,Fy,Fyb,Lub,Lua,JKa,JKb,M,N,S,s,PI,Xgaا Anti-A A1-A2B(3) Anti-B A1B(3)-B Anti-AB A1(3)-B(4)-A2(2)-Ax(3)

آزمایش Specificity نباید آنتی سرم را رقیق کرد حد اکثر 7 روز از زمان خونگیری گذشته باشد آزمایش تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن آزمایش جهت تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها

تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن حداقل از 4 اهداکننده ، خون جمع آوری شود برای هر آنتی سرم به طور جداگانه سلول تهیه شود در هر سری کاری حد اقل یک سلول قرمز فاقد آنتیژن مربوطه، به عنوان کنترل منفی آزمایش شود.

حداقل سلولهائی که برای آزمایش specificity لازم میباشد Red Blood Cells Reagent A1 (1) and A2B (3)* Anti-A A1B (3) and B (1) Anti-B A1 (2) and A2 (2) ** and B (4) And at least 3 different Ax*** Anti-A,B

تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها آنتی سرم را با سلول های زیر مجاور کرده و آزمایش کنید: A, B, H, Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb ,Pi , D , C , E , c , e , Cw , M , N , S , s , U , Lua , Lub , JKa , JKb , Fya , Fyb , Xga , Doa , Dob , Yta , Ytb , Lan , Coa , Cob , Mg , Wra , Sda ,Vw در صورتی که آنتی سرم منوکلونال بوده و این کلون قبلاً بررسی و تائید شده میتوان فهرست فوق را خلاصه تر کرد: A , B , H , Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb, Pi , D , C , E , c , e , M , N , S , s , U , Lub, JKa , JKb , Fya , Fyb حداقل از 4 اهداکننده ، خون جمع آوری شده و آزمایش مستقیم انجام شود.

نحوه تفسیر نتایج specificity در هیچیک از واکنشها نباید همولیز و یا رولو دیده شود. برای تائید حضور آنتی ژن ، واکنشهای مثبت باید حداقل 2 + باشد.اگر یکی از 4 خون مورد آزمایش ، واکنش کمتر از 2+ داشته باشد باید 4 خون دیگر را آزمایش کنید.در صورتیکه فقط یکی از این 8 آزمایش دارای واکنش کمتر از 2+ داشته باشد ، نتیجه را قابل قبول بشناسید. مواردی که عدم حضور آنتی ژنها را بررسی میکنیم باید واکنشها منفی باشند

Anti-A & B False Agglutination(BOB) 10% saline suspension of cell Rh+(once washed with 0.15 M saline& Unwashed) 100λ cell +100λ serum Mix two minutes (room temperature) or(slide area 1×3 in.) No agglutination, hemolysis, rouleaus formation

آزمایش از نظر آگلوتیناسیون خود به خود رقتهای آنتی سرم: نیازی به رقیق سازی نمی باشد آنتی سرم با سلول O منفی نباید واکنش آگلوتیناسیون ایجاد نماید (سلول O منفی حاوی آنتی ژن c که توسط آنتی بادی Anti-c از نوع IgG پوشیده شده)

package & container Container Color of label paper Information Lettering size Visual inspection Package label

stability control Minimum of 1% of each batch Should be retained at least 6 months beyond expiry date

روش پیشنهادی مرکز ملی خون صلیب سرخ تایلند روش پیشنهادی مرکز ملی خون صلیب سرخ تایلند

ارزيابي آنتي سرم گروه خوني Anti-Rh

Universal precautions HIV HBV

Appearance NO……. hemolysis Precipitate Particle Gel-formation ………………… in inspection

Contamination Culture must be negative Using validate process to produce Preservative Sterile filter

Anti-Rh(FDA) Titration 1+ > 1/16(FDA) , 1/32(BOB) Or = reference Serial two fold dilution (anti-Rh) 2% suspension cell Rh+ 100 anti-Rh + 100 cell Incubation(One hour 37c) Centrifuge(45 sec at 1000 g) Reading & grading 1+ > 1/16(FDA) , 1/32(BOB) Or = reference

Anti-Rh(BOB) Titer Two fold dilution serum in 20% albumin “ “ “ “ salin 2% suspension RBC(Rh2) with albumin “ “ “ salin 0.1 ml serum dilution+0.1 ml RBC Incubate 37°C for 60 minutes Centrifuge (2 minures at 1000 rpm) [a control  albumin+RBC “  erum dilution + RBC Rh negative] Observe for agglutination 1+ > 1/32

بررسی Potency برای رقیق سازی باید از لوله ای شروع کرد که آنتی سرم رقیق نشده و سپس با رقیق سازی 12/1 ، 4/1 ، 8/1 ...... ادامه داد. برای رقیق سازی، از سالین ایزوتونیک حاوی آلبومین 2-1 % استفاده شود. لوله آزمایش75 mm 12× یا بزرگتر به کار برید تیتراسیون را تا جائی که به نتیجه منفی برسید ادامه دهید تیتراسیون را با آنتی سرم رفرانس به طور همزمان ، مطابق روشی یکسان انجام دهید برای جلوگیری از carry over بهتر است سر سمپلرها را برای هر رقت ، تعویض نمائید. جهت کنترل ایزوتون ، آخرین لوله را با ایزوتون بدون آنتی سرم پر نمائید.

حداقل سلولهائی که برای آزمایش potency لازم میباشد Reagent Red Blood Cells Anti-D Dce ( R0r ) Anti-C dCce ( r’ r ) Anti-E dcEe ( r’’ r ) Anti-c DCcEe ( R1 R2 ) Anti-e DcEe ( r’’ r ) Anti-cd dCce ( r’ r ) & DCe ( R2 r ) Anti-DE Dce (R0 r ) & dcEe ( r’’ r ) Anti-CDE dCce ( r’ r ) & Dce ( R2 r ) & dcEe ( r’’ r )

روش انجام کار برای بررسی potency میلی لیتر از معرف آنتی سرم را در لوله آزمایش ریخته و رقت سریال تهیه کنید طوری که در هر لوله آزمایش 0.1 میلی لیتر آنتی سرم باشد میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی ( محلول 2% گلبول قرمز که با ایزوتون حاوی 2% آلبومین تهیه شده) را به هر لوله اضافه کنید محتویات لوله ها را به خوبی مخلوط کنید. 15 دقیقه در حرارت 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید سپس با دور rpm 1000(100-125 rcf) به مدت دو دقیقه و یا 3400 rpm به مدت 45 ثانیه (900-1000 rcf ) سانتریفوژ کنید .

آخرین لوله ای که واکنش +1 دارد به عنوان تیتر potency در نظر گرفته شود رقیق سازی تا حداقل ، یک لوله بعد از endpoint ادامه داشته باشد لوله آنتی سرم بدون سلول باید منفی شود. آنتی سرم های Rh حد اقل تیتری مساوی تیتر آنتی سرم رفرانس داشته باشد

FDA & WHO برای low protein anti-D از استاندارد 99/836 با رقت 1/3 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد برای high protein anti-D از استاندارد 99/836 با رقت 1/8 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد

Anti Rh Specificity reaction With cell + Rh+ - Rh- Confirm reaction with A,B,AB At least 2+ reaction B. Confirm absence of reaction with panel cell due to Ab contamination D,C,E,c,e,cw,k,R,Kpa,Kpb,Fy,Fyb,Lub,Lua,JKa,JKb,M,N,S,s,PI,Xgaا reaction With cell + Rh+ - Rh-

آزمایش Specificity: نباید آنتی سرم را رقیق کرد حد اکثر 7 روز از زمان خونگیری گذشته باشد آزمایش تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن آزمایش جهت تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها آزمایش جهت تائید عدم حضور anti-A , anti-B

تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن حداقل از 4 اهداکننده ، خون جمع آوری شود به عنوان مثال برای بررسی anti-CDE حداقل 4 اهدا کننده برای جزئ anti-C و 4 خون برای anti-D و 4 خون برای anti-E به کار رود. برای هر آنتی سرم به طور جداگانه سلول تهیه شود در هر سری کاری حد اقل یک سلول قرمز فاقد آنتی ژن مربوطه، به عنوان کنترل منفی آزمایش شود.

تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها آنتی سرم را با سلول های زیر مجاور کرده و آزمایش کنید: A, B, H, Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb ,Pi , D , C , E , c , e , Cw , M , N , S , s , U , Lua , Lub , JKa , JKb , Fya , Fyb , Xga , Doa , Dob , Yta , Ytb , Lan , Coa , Cob , Mg , Wra , Sda ,Vw در صورتی که آنتی سرم منوکلونال بوده و این کلون قبلاً بررسی و تائید شده میتوان فهرست فوق را خلاصه تر کرد: A , B , H , Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb, Pi , D , C , E , c , e , M , N , S , s , U , Lub, JKa , JKb , Fya , Fyb

آزمایش جهت تائید عدم حضور anti-A , anti-B از گلبولهای قرمز حاوی آنتی ژن A1 و B که فاقد آنتی ژنهای D باشد استفاده کنید. ( از گلبول A1B می توان نیز استفاده کرد. )

نحوه تفسیر نتایجspecificity در هیچیک از واکنشها نباید همولیز و یا رولو دیده شود. برای تائید حضور آنتی ژن ، واکنشهای مثبت باید حداقل 2 + باشد.اگر یکی از 4 خون مورد آزمایش ، واکنش کمتر از 2+ داشته باشد باید 4 خون دیگر را آزمایش کنید.در صورتیکه فقط یکی از این 8 آزمایش دارای واکنش کمتر از 2+ داشته باشد ، نتیجه را قابل قبول بشناسید. کنترل منفی ، باید واکنش منفی نشان دهد. مواردی که عدم حضور آنتی ژنها را بررسی میکنیم باید واکنشها منفی باشند.

Anti-Rh Avidity (BOB) 40% suspension RBC RH positive in their own plasma or serum, or in AB plasma or serum 100λ cell + 50 λ serum (slide area 20*40) Place on illuminated glass ( T<47 °C) The end of 2 minutes record size of clump Beginning before 60 seconds Clump at least 1mm/2 min RBC  Dce(Rh1) / Dce(Rh0) / DcE(Rh2)

بررسی Avidity رقت 2/1 را با مخلوط کردن مقادیر مساوی آنتی سرم مورد آزمایش و سرم AB که فاقد آنتی بادی میباشد و یا با هر رقیق کننده ای که سازنده توصیه کند ، تهیه کنید گلبول قرمز را سازنده ، مطابق روشهای خود تهیه کند

حداقل سلولهائی که برای آزمایش Avidity لازم میباشد: Reagent Red Blood Cells Anti-D DCe ( R1 r ) Anti-C dCce ( r’ r ) Anti-E dcEe ( r’’ r ) Anti-c Anti-e Anti-CD Dce ( R0 r ) & dCce ( r’ r ) Anti-DE Dce ( R0 r ) & dcEe ( r’’ r ) Anti-CDE Dce (R0 r ) & dcEe ( r’’ r )

انجام آزمایش: آزمایش را با آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده به روش اسلاید انجام دهید. نتیجه آزمایش را در زمان ادعا شده توسط سازنده و همچنین در نصف زمان فوق ، یادداشت کنید نشانه های آگلوتیناسیون، در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده درپایان نیمه اول زمان واکنش ( که توسط سازنده ادعا شده بود )باید مشاهده شود. آگلوتیناسیون واضح ،در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده، درپایان زمان واکنش ، به صورت توده کمتر و یا بزرگتر از یک میلیمتر گزارش گردد.

آزمایش پدیده پروزون نباید آنتی سرم را رقیق کرد حد اقل سه نمونه خون با سه فنوتیپ مختلف Rh تهیه کنید حد اکثر 7 روز از زمان خونگیری گذشته باشد آزمایش آنتی گلوبین مستقیم انجام دهید و مطمئن شوید سلولهای قرمز پوشیده از آنتی بادی نمی باشند. سلولها را حداقل دو بار با سالین شستشو دهید تا مایع روئی شفاف شود

سلولهای پیشنهادی برای آزمایش پروزون Reagent Red Blood Cells Anti-D DCce ( R1 r ) Anti-C DCcEe ( R1 R2 ) Anti-E Anti-c DCce ( R1 r ) & DCcEe ( R1 R2 ) Anti-e DcEe ( R2 r ) & DCcEe ( R1 R2 )

انجام آزمایش برای هر سلول ، سه لوله آزمایش آماده کنید. روی هر کدام برچسب 15 دقیقه – 30 دقیقه – 60 دقیقه بزنید مقادیر مناسبی از آنتی سرم را در هر لوله بریزید. به هر لوله سلول اضافه کنید آنها را مخلوط کرده و هر یک را طبق برچسب ، انکوبه در دمای مناسب انکوبه کنید طبق روش بروشور ، سانتریفوژ کنید

-اگر درجه واکنش در هر سه لوله یکسان است و یا به ندریج واکنش بیشتر شده ، پدیده پروزون وجود ندارد -در صورتیکه با افزایش زمان انکوباسیون ، میزان واکنش کاهش نشان بدهد ، پروزون وجود دارد حداقل واکنش +2 در تمامی لوله ها باید مشاهده شود

روش دوم برای آزمایش پروزون روش دوم برای آزمایش پروزون دو سری لوله ( در هر سری 5 لوله ) آماده کنید. برچسب 1 ثانیه – 1 دقیقه -3 دقیقه – 5 دقیقه – 10 دقیقه روی هر سری از لوله ها بزنید در یک سری از لوله ها آنتی سرم رقیق شده و در سری دوم آنتی سرم رقیق شده بریزید به هر لوله مقدار مناسبی سوسپانسیون سلولی اضافه کنید مخلوط کرده و در دمای منا سب ، طبق برچسبها ، انکوبه کنید طبق بروشور سانتریفوژ کنید اگر درجه واکنش در لئله های رقیق شده قویتر از لوله های رقیق نشده بود ، پدیده پروزون وجود دارد اگر درجه واکنش در لوه های رقیق شده مساوی و یا ضعیفتر از لوله های رقیق نشده بود ، پروزون وجود ندارد.

Anti-Rh(BOB) Three test tube (0.25 ml serum) false agglutination Three test tube (0.25 ml serum) 0.25ml (2% cell suspension once washed AB- Incubate  37°C (1 hour)  RT( 2 hour) 2-10 °C ( “ )  “ RT( 3 hour) No agglutination, hemolysis, rouleaux formation

Anti Rh 6-Reaction with Du+ Antihuman Globulin test

stability control Minimum of 1% of each batch Should be retained at least 6 months beyond expiry date

package & container Container Color of label paper Information Lettering size Visual inspection Package label

روش پیشنهادی مرکز ملی خون صلیب سرخ تایلند روش پیشنهادی مرکز ملی خون صلیب سرخ تایلند

THE END